★课题目标（一）知识与技能
1、了解PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、讨论PCR的应用 （二）过程与方法
在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件
（三）情感、态度与价值观
通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神 ★课题重点
PCR的原理和PCR的基本操作 ★课题难点 PCR的原理 ★教学方法 启发式教学 ★教学工具 多媒体课件 ★教学过程
（一）引入新课
在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。
（二）进行新课 1．基础知识
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PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似： 1．1细胞内DNA复制条件分析： 条件 模板 原料 酶 DNA聚合酶 能量 引物 ATP RNA 催化合成DNA子链 为解螺旋和合成子链供能 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点 组分 DNA的两条单链 四种脱氧核苷酸 解旋酶 作用 提供复制的模板 合成DNA子链的原料 打开DNA双螺旋 1．2细胞内DNA复制过程
（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6） 核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。 DNA双螺旋结构的反向平行结构： （2）DNA的复制过程:
解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。
引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。 DNA聚合酶结合：
子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。
［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？
DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。 ［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。 1．3DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
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恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。 反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。 ［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质） 4．PCR的反应过程
变性：在95℃时DNA解旋
复性：在50℃时引物与DNA单链结合
延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）
2．实验操作
2．1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水
2．2 实验操作步骤
2．3 按照PCR反应体系配方配制反应液；
（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中； （3）将微量离心管放到PCR仪中； （4）设置PCR仪的工作参数。 （5）DNA在PCR仪中大量扩增。
2．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。 3．实验注意事项
3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。 3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。 3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。 4．结果分析与评价
4．1反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL
变性 复性 延伸 - 3 -
蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。
4．2将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。 4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数 （三）课堂总结、点评
多聚酶链式反应扩增DNAPCR原理 DNA的复制需要酶、原料、能量、引物 DNA的变性和复性受温度影响 变性 复性 延伸 移入离心管 放入PCR 计算 PCR过程 操作步骤 配制PCR反应体系 设置工作参数 调零 DNA扩增 测定含量 稀释 片段测定并读数 （四）实例探究
例1 在（ ）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开
A. 10－20℃ B. 80－100℃ C. 20－30℃ D. 40－60℃ 解析：蛋白质大多不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。 答案：B
例2 关于DNA的复制，下列叙述正确的是（ ）
A. DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链 B. DNA复制不需要引物
C. 引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D. DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸
解析：由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。
答案：C ☆综合应用
例3 下列有关PCR描述，不正确的是（ ） A. 是一种酶促反应
B. 引物决定了扩增的特异性 C. 扩增产量按y＝（1＋X）n D. 扩增对象是氨基酸序列 E. 扩增对象是DNA序列
解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝（1＋X）n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x
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表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选D。
答案：D ★课余作业
1、PCR与生物体DNA复制有何区别？
2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？ ★教学体会
教师在教学过程中，可以鲜引导学生回忆必修2的有关DNA复制的知识，在此基础上，学生可加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。
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