牛羊肉毒梭菌渊C型冤灭活苗的
研制及免疫效果观察
刘来利袁李元新袁王必成袁冯玲霞袁张鹏岳
渊甘肃省畜牧兽医研究所袁甘肃平凉744000冤
摘
要院采用我所分离并保存的对本地区牛羊肉毒梭菌病具有良好免疫原性的菌株Nb6514研制成功牛羊肉毒梭菌渊抗C10型冤个灭活小鼠苗最遥小用致免死疫量牛尧/羊mL血曰30d清作分别小白可鼠抗体外30~280中和试和验20~240来测定个抗最体效小致价袁死结量果/表mL明血院结清果曰180d显示袁达免到疫高10d峰袁的分别牛羊均可可
抗300~1600和200~1200个小白鼠最小致死量/mL血清曰至550渊一年半冤仍可抗10个最小致死量/mL血清遥结果表明研制的牛羊肉毒梭菌渊C型冤灭活苗具有良好的免疫效果袁能有效预防牛羊肉毒梭菌渊C型冤病遥关键词院牛曰羊曰肉毒梭菌渊C型冤曰灭活苗DOI:10援3969/J.ISSN援1671-6027援2016援03.015
肉毒梭菌是一种革兰阳性厌氧芽孢梭菌袁其产生的肉毒在鲜血琼脂平板上厌氧环境条件下37℃培养48h袁菌落不规毒素能引起人畜严重的中毒症状袁甚至导致死亡遥肉毒梭菌则的圆形袁直径3mm左右袁半透明袁边缘不整袁有略大于菌落芽孢广泛分布于自然界袁土壤为其自然的存留场所袁动物肠的溶血圈遥道内容物尧粪便尧腐败尸体尧腐烂饲料及其各种植物中都常含1.2.3血清学特性用肉毒梭菌定型血清作中和试验检查袁
有肉毒梭菌芽孢袁这种芽孢在适宜的条件下就能生长繁殖产应为C型遥生外毒素遥C型肉毒素是迄今为止已知毒力最强的毒素袁1mg1.2.4毒力
各菌株用加入以无菌操作采取的新鲜生肝块
纯毒约含1万个人的致死量或能使4×1212只小鼠致死遥反的厌气肉肝汤或肉肝胃酶消化汤培养5~7d的菌液上清液刍类家畜牛尧羊尧骆驼及啮齿类动物鼠尧兔尧貂等对C型肉毒0.00005~0.0001mL袁腹腔注射体重250~300g豚鼠袁应在7d毒素特别敏感袁非常容易引起中毒死亡遥这种病常年均有中内死亡遥或以0.00001~0.00002mL静脉注射体重14~16g小毒病例发生袁以冬春秋末较为多见袁而且发病可呈几年连续白鼠袁应在3d内死亡遥性袁家畜中青壮年牛羊发病为多袁病死率高达79.53%遥对畜1.2.5免疫原性
用体重1.5~2kg家兔4只袁各皮下注射
牧业造成严重的经济损失遥为此袁研制出用于预防C型肉毒1mL遥21d后连同条件相同的对照兔2只袁各静脉注射10个梭菌中毒症灭活疫苗袁并对免疫效果进行了观察袁现报告如致死量的毒素袁观察14d对照兔应全部死亡袁免疫兔应至少下院保护3只遥1材
料
1.2.6纯粹
用适宜培养基检查袁应纯粹遥
1.2.7基础种子代数1~10代遥
制造与检验用的菌种为C型肉毒梭菌菌株袁系1965年从甘肃省安西县渊现为瓜州县黄牛体内冤袁经中国兽医药品监在2－8℃袁保存期为10年遥
察所鉴定为C型肉毒梭菌菌株遥现由甘肃省畜牧兽医研究所保存遥
试验动物院豚鼠袁体重300～400g曰家兔袁体重1.5～2.0kg曰小白鼠袁体重18～22g遥
1.2.1形态和生化特性
本菌为革兰氏阳性粗大杆菌袁陈旧
培养物往往变成革兰氏阴性袁产生偏端芽孢遥生化特征应符鱼渊或冤肉胃胃酶消化肉肝汤培养基曰硫乙醇酸盐渊TG冤培合细菌分类学中本菌的特性遥养基袁酪胨琼脂渊GA冤培养基和葡萄糖蛋白胨汤渊GP冤培养基1.2.2培养特性
本菌为严格的厌养菌袁在肉肝胃酶消化汤
半固体培养基中呈中等生长袁在厌气肉肝汤中生长不良或不渊畜牧兽医研究中国兽药监督所提所提供供冤冤遥
袁普通琼脂斜面尧厌气肉肝汤渊甘肃省生长袁培养基中加入新鲜生肝块时袁生长良好袁产气袁有臭味遥
氢氧化铝胶袁购自甘肃省某药厂遥
基金项目院甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目袁项目2方
法
编号院GNSW-2012-15作者简介院刘来利渊1963~冤袁甘肃省静宁县人袁本科,副研究2.1.1一级种子繁殖及鉴定
将菌种接于厌气肉肝汤或肉
员袁主要从事动物疫病防治与疫苗开发研究工作
肝胃酶消化半固体渊含0.05%琼脂袁0.5%明胶冤培养基中袁于26
2016年第03期畜牧兽医科技信息.com.cn. All Rights Reserved.37℃培养3d后袁测毒及涂片镜检袁应纯粹并用普通琼脂斜面尧厌气肉肝汤及普通肉汤各2管袁每管接种0.2mL袁培养3~5d袁应纯粹袁即作为一级种子管袁在2~8℃保存袁使用期不超过15d遥为便于使用袁也可将产芽孢的菌种移植于加新鲜生肝块厌气肉肝汤中袁在2~8℃保存袁每3个月继代培养1次袁在培养基上继代袁不超过4代遥
本试验菌种纯粹性检验采用上述方法袁一级二级种子管培养基均采用保蒲氏胰酶消化半固体培养基培养保存备用遥2.1.2二级种子繁殖将一级种子1~2株袁接种于培养中袁
置37℃培养3~5d袁抽样做纯检袁应纯粹袁在2~8℃保存袁应用
期应不超过5d遥2.2.1用培养罐或玻璃培养瓶培养
按容量装入80%左右
的培养基袁用玻璃瓶培养时加入1/10肝块袁用反应缸时不加肝块袁而按5:1加入氢氧化铝胶袁混合后袁118℃灭菌60min袁玻璃瓶需或培养罐均需冷至37℃左右袁按培养基总量的1%~2%接入种子袁同时加入灭菌的葡萄糖溶液袁使其最终含量为0.5%袁30~35℃静止培养5~7d袁培养基如经存放袁在接种前应煮沸驱氧袁冷至37℃左右立即接种遥2.2.2纯粹检验
菌液培养完成后袁取样接种普通琼脂斜
面尧厌气肉肝汤和普通肉汤各一管袁每管接种0.2mL袁培养7d袁应纯粹遥2.2.3毒素测定
每批抽样测定毒素遥用体重14~16g的小
白鼠静脉注射袁1mL不应低于50000MLD遥采用小白鼠腹腔注射测毒袁剂量为0.5mL/只袁毒素稀释液采用0.2%明胶磷酸盐缓冲液渊pH为6.8冤遥采用10倍递度稀释遥2.2.4灭活脱毒
培养罐渊或玻璃瓶冤培养袁按菌液量0.8%加入甲苯醛溶液袁并按0.01%加入硫柳汞曰在37℃脱毒10d袁摇瓶2次/d遥2.2.5灭活检验
每瓶取样接种普通琼脂斜面尧普通肉汤尧
加新鲜生肝块的厌气肉肝汤袁或加0.05%琼脂尧0.05%明胶的半固体培养基各1管袁每管接种菌液0.2mL袁在37℃培养5~10d袁应无菌生长遥2.2.6脱毒检验
在无菌检验同时袁每瓶取样接种豚鼠袁每
只皮下注射4mL袁观察7~14d不应死亡曰或离心取上清液袁静脉注射体重16~20g小白鼠2只袁0.4mL/只袁观察5d袁不应死亡遥如有豚鼠或小白鼠死亡袁应继续脱毒遥
灭活检验合格后袁玻璃培养的滤出肝块袁按菌
液5份加铝胶1份的比例加入无菌氢氧化铝胶袁用8%氢氧化钠调节至pH7.0±0.2袁充分摇匀遥用反应缸加铝胶培养的菌液可直接调pH7.0±0.2袁按配制后的总量的0.004%加入硫柳汞遥
2.3.1半成品检验
配苗完成后袁取样做无菌检验遥做厌氧
性尧需氧性细菌检验及霉菌及腐生菌检验渊葡萄糖蛋白胨汤培养基G.P冤袁灭菌效果检验渊保蒲氏胰酶消化液半固体培养基冤袁应无菌生长遥2.3.2分装
经无菌检验合格后袁进行定量分装袁分装时应
随时搅拌袁使其混合均匀遥2~15℃保冷暗处存遥
畜牧兽医科技信息试验研究
2.4.1物理性状本品静置后袁上层为橙色澄明液体袁下层为灰白色沉淀袁振摇后呈均匀混悬液遥
2.4.2无菌检验
每批随机抽取5瓶灭活苗袁混合后取
1.0mL接种于含硫硫乙醇酸盐培养基渊T.G冤50mL袁置37℃培养袁3d后自小瓶中吸出培养物遥分别接种T.G小管和酪胨琼脂培养基渊G.A冤各2支袁0.2mL/支袁1支置37℃培养曰1支置25℃袁另取0.2mL袁接种1支葡萄糖蛋白胨培养基渊G.P冤小管置25℃袁培养5d袁观察有无细菌生长遥2.4.3安全检验每批苗用体重300~350g豚鼠4只袁各皮下注射疫苗4mL观察21d遥
2.4.4效力检验
对不同批次的牛羊肉毒梭菌渊C型冤湿苗
和干粉剂苗用体重1.5~2kg家兔4只袁各皮下注射1mL遥21d后连同条件相同的对照兔2只袁各静脉注射10个致死量的毒素袁观察14d遥2.4.5免疫测定用免疫牛羊血清作小白鼠体外中和试验袁
分别在10d尧30d尧180d尧360d进行抗体效价测定遥
3试验结果
观察发现袁接种湿苗的硫乙醇酸盐培养基
对T.G照冤管小均管无尧细酪胨菌无琼细脂菌生斜面渊长G.A遥
冤和葡萄糖蛋白胨汤渊G.P冤及3批湿苗接种检验用豚鼠后袁试验豚鼠食欲
正常袁精神状态良好袁10d后观察注射部位无坏死袁均健活袁安
全检验合格遥见表1表1灭活苗的的安全检验结果
分别对三批温苗作近期效力试验袁保护率结果见表2表2灭活苗近期效力试验结果
三个批次其中二个批次对10个致死量的C型肉毒梭菌毒素的保护率为100%袁一个批次对10个致死量的C型肉毒梭菌毒素保护率为75%袁对照组的死亡率为100%遥
用免疫牛羊血清作小白鼠体外中和试验袁分
别在10d尧30d尧180d尧360d进行抗体效价测定遥
结果显示袁免疫10d的牛羊均可抗10个小鼠最小致死量/mL曰30d分别可抗30~280和20~240个最小致死量/mL血清曰180d达到高峰袁分别可抗300~1600和200~1200个小白鼠最小致死量/mL血清曰至550渊一年半冤仍可抗10个最小致死量/mL血清遥4小结与讨论
通过对我所所分离并保存的C型肉毒棱菌Nb6514菌
2016年第03期
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渊.com.cn. All Rights Reserved.试验研究
呼伦贝尔犊牛免疫前后口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果对比分析
王冠玉1根塔娜袁1渊1.内蒙袁冯苏日岩2古格袁王1袁景田春3宗民袁王1袁余巍1格兴邦袁
1
2.古海呼拉伦贝尔尔区动市物动疫病物疫病预防控制中预防控制中心袁心海袁拉内尔蒙内古蒙呼古伦贝尔021008021008曰
曰
3.莫力达瓦达斡尔族自治旗动物疫病预防控制中心袁内蒙古莫力达瓦162850冤
DOI:10援3969/J.ISSN援1671-6027援2016援03.016
口蹄疫渊footandmouthdisease袁FMD冤是一种高度接触ELISA试剂盒渊FMDV20151020E冤曰甘肃某品牌口蹄疫病毒性病毒传染病袁传播速度快袁发病率高袁可对养殖业造成巨大3ABC单抗阻断ELISA抗体检测试剂盒渊20151113129冤曰北的经济损失遥世界动物卫生组织渊OIE冤将其列入A类动物传京某品牌口蹄疫病毒通用型RT-PCR检测试剂盒染病之列袁我国农业部将其作为一类动物疫病中的重点重大动物疫病遥目前袁我国口蹄疫的主要防治措施依然是以灭活渊FMD20151202P冤曰甘肃某品牌口蹄疫三价灭活疫苗遥
疫苗免疫为主袁如何有效区分感染抗体与免疫抗体一直以来不同月龄尧不同饲养环境下的临床健康犊牛30头袁来源都是口蹄疫防控工作中亟待解决的重要难题遥3ABC是口蹄于免疫背景清晰尧生产记录详细的规模化养牛场遥
疫病毒的一种非结构蛋白袁它参与口蹄疫病毒RNA复制过程袁是口蹄疫病毒一个高度保守区域遥利用原核和真核系统对30头犊牛于初免前尧免疫口蹄疫三价灭活苗后1个表达的3ABC蛋白能与全部7个血清型的口蹄疫病毒感染月共2次分别采集一一对应的血清及O-P液样品袁进行口蹄血清发生免疫反应袁是鉴别免疫动物和感染动物的理想抗原疫病毒3ABC非结构蛋白检测和分子生物学RP-PCR检测遥之一遥通过ELISA方法检测口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白袁在进行3ABC非结构蛋白检测时袁采用4种实验方案进行检是国内各地动物防疫机构鉴别口蹄疫病毒感染抗体与疫苗测院渊方案1冤是将90份血清样品袁按总体积比1院2比例进行免疫抗体的最常用手段袁对指导口蹄疫防控工作具有至关重稀释袁用北京品牌试剂盒进行检测曰渊方案2冤按照1院5比例稀要的作用遥
释袁用北京品牌试剂盒进行检测曰渊方案3冤按照1院2比例稀本文通过使用两种诊断试剂按不同比例稀释被检样品袁释袁用甘肃品牌试剂盒进行检测曰渊方案4冤按照1院5比例稀对比实验犊牛免疫前后口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白的检释袁用甘肃品牌试剂盒进行检测遥测结果袁发现实验结果存在明显变化遥并分析结果总结规律袁2实验结果
针对可能存在的影响因素袁提出改进建议遥1材料与方法
免疫前采集的血清样品进行口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测后袁在1院2比例稀释下袁北京品牌的诊断试剂共检北京某品牌口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断
出阳性样品5份袁疑似样品23份袁阴性样品2份曰其余方案
株的抗原结构分析袁毕获恩等研究表明袁该菌株与其他5株体水平袁可抗10个最小致死量/mL血清遥这对今后制定牛羊渊肉毒梭菌渊C型冤灭活苗的免疫程序和注射后抗体的跟踪监素Nb6507之间的尧交叉Nb6516中和尧Nb65力基本试一尧Nb6521致袁并与尧Nb6574兰州生冤物制品的毒素与抗毒所实验室测提供了依据遥
保存的91号C型菌均有交叉保护作用遥本项目虽用一株菌
参考文献
体制苗袁但对其他菌株有较好地预防作用遥
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对研制的牛羊肉毒梭菌渊C型冤灭活苗进行了无菌检验出版社袁1996.5.
和安全检验袁试验结果表明安全可靠遥
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/mL曰180d达到高峰袁分别可抗300~1600和200~1200个小苗冶的试验总结[J].西藏科技袁2003渊5冤院55-56.
白鼠最小致死量/mL血清曰至550渊一年半冤仍具有较高的抗28
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