PCR的退火温度选择

设定Tm有。几种公式。有的是来源。于高盐溶液中的杂交，适用于小于。18碱基的.引物。 有的是根据.GC含量估.算Tm.确定引物T。m最可信的方法是近邻。分析法.这种方法从.序列一级结。构和相邻碱。基的特性预。测引物的杂交稳定性.大部分计算。机程序使用。近邻分析法.

根据所使用.的公式及引.物序列的不.同,Tm会差异。很大。因为大部分公式提供一。个估算的T。m值,所有退火温度只是一个。起始点。可以通过分.析几个逐步.提高退火温.度的反应以。提高特异性。。开始低于估。算的Tm5。℃,以2℃为增量，逐步提高退。火温度.较高的退火。温度会减少。引物二聚体和非特异性产物的形成。。

为获得最佳。结果，两个引物应.具有近似的.Tm值。引物对的T。m差异如果.超过5℃，就会引物在循环中使用。较低的退火温度而表现。出明显的错。误起始。如果两个引。物Tm不同,将退火温度。设定为比最.低的Tm低.5℃

或者为了提。高特异性,可以在根据。较高Tm设。计的退火温。度先进行5个循环，然后在根据.较低Tm设计的退火温度进行剩余。的循环。这使得在较为严紧的条.件下可以获。得目的模板.的部分拷贝。。

当引物长度.低于20个。bp可以根据Tm=3GC+2AT，对于更长的。寡聚核苷酸。，Tm计算公.式为：

Tm = 81.5 + 16。6 x Log10。［Na+] + 0.41 (%GC） – 600/size 公式中，Size = 引物长度.

退火温度取.决于引物长.度及序列，GC含量越。高退火温度。越高，引物的Tm。值减去5—8度即是引物的退火温。度，引物的Tm。值一般都会.在引物合成.单上体现，如果没有的话可以在网。上搜个引物.退火温度计。算器输入序。列就可以了。。 退火时间一般都是30。秒。

试试下载一个Olig.o6。0,这个软件挺不错的，在计算出来.的退火温度.基础上上下。幅度一点 是没有什么问题的

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我们刚做了PCR实验。，当引物长度小于25b.p时，退火温度通。过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）

增加PCR.的特异性： 1. prime。rs desig.n

这是最重要。的一步.理想的,只同目的序.列两侧的单.一序列而非。其他序列退火的引物要。符合下面的。 一些条件

a。 足够长,18-24bp，以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物.同样会降低。特异性，并且降低产。量

b. GC% 40％~~～～60% c。 5'端和中间序列要多GC，以增加稳定.性 d。 避免3'端GC rich， 最后3个B。ASE不要有GC,或者最后5。个有3个不。要是GC e. 避免3’端的互补, 否则容易造.成DIME.R f。 避免3'端的错配 g。 避免内部形成二级结构

h. 附加序列(RT site, Promoter seque.nce）加到5’端， 在算Tm值。时不算，但在检

测互。补和二级结.构是要加上.它们

i。 使用兼并引。物时， 要参考密码。子使用表,注意生物的。偏好性,不要在3’端使用兼并.引物，并使用 较高的引物浓度(1uM—3uM)

j。 最好学会使.用一种de.sign softw.are. PP5，Oligo。6，DNAst.ar, Vector NTI， Onlin。e desgin et al.

* 引物的另一个重要参数.是熔解温度。（Tm）.这是当50.％的引物和互.补序列表现.为双链DN.A分子时的。温度。Tm对于设定PCR退。火温度是必。需的.在理想状态下，退火温度足。够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足.够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55.℃到70℃.退火温度一。般设定比引。物的 Tm低5℃。

设定Tm有。几种公式。有的是来源。于高盐溶液。中的杂交,适用于小于。18碱基的引物。 有的是根据GC含量估.算Tm.确定引物Tm最可信的。方法是近邻。分析法。这种方法从.序列一级结。构和 相邻碱基的。特性预测引。物的杂交稳.定性.大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用.的公式及引。物序列的不。同，Tm会差异。很大.因为大部分公式提供一。个估算的T.m值，所有退火温。度只是一个.起始点。可以通过分.析几个逐步。提高退火温。度的反应以。提高特异性.。开始低于估.算的Tm5.℃,以2℃为增量，逐步提高退火温度.较高的退火温度会减少。引物二聚体。和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应.具有近似的。Tm值.引物对的T。m差异如果。超过5℃，就会引物在。循环中使用。较低的退火。温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度。设定为比最低的Tm低。5℃

或者为了提.高特异性，可以在根据。较高Tm设.计的退火温度先进行5。个循环，然后在根据。较低Tm设。计的退火温。度进行剩余。的循环。这使得在较为严紧的条.件下可以获.得目的模板。的部分拷贝。。

2。 stabi.lity of primers

定制引物的。标准纯度对于大多数P.CR应用是。足够的。

引物产量受合成化学的.效率及纯化方法的影响。.定制引物以。干粉形式运.输。最好在TE。重溶引物,使其最终浓.度为100μM。TE比去离。子水好，因为水的p.H经常偏酸。，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储。存条件。应将干粉和。溶解的引物。储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引。物在 —20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不。到1周.干粉引物可以在—20℃保存至少1年，在室温(15℃到30℃）最多可以保.存2个月。

3。 optim.ize reactants concentrat。ion a。 magnesiom ions

Mg离子的作用主要是。 dNTP—Mg 与核酸骨架.相互作用 并能影响P。olyme。rase的。活性，一般的情况。下 Mg的浓度。在0.5-5mM之间。调整，同样要记住的是在调整。了dNTPs的浓度后。要相应的调整Mg离子的浓度，对实时定量。PCR，使用3到5.mM带有荧.光探针的镁。离子溶液

b. 其他的离子。

NH4+ K+都会影响P。CR,增加K+的浓度后, 会因为中和。了核酸骨架。上磷酸基团。的负电荷而。影响退火的温度，从而降低了。PCR的 严谨性(stringency），NH4+也有相同的作用。 MBI公司.的TAQ酶。就提供了两。种BUFF.ER， 一种是加M。g的一种是已经混合了（NH4）2SO4的。，当然, 过高的阳离。子浓度（KCL>0.2M）时, DNA在94度根本不。会发生变性。, 当然也就无从谈起PCR了. c. polymerase。

不同公司的。酶效有所不同，需要operator。自己掌握适.合的酶的浓度,一些高保真没的效率要.远远低于T。aq polym。erase.,所以可能需.要的酶的量。也要大一些。。 另外, 一般的 情况下， 变性的温度。可以使用9。0～92度， 变性的时间.也可以缩短.,从而保证polyme。rase的。活性 d。 templ.ate 50ul PCR SYSTE。M

================================ human gDNA 0。1ug—1ug E。Coli 10ng—100ng. Lamad。aDNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng—10ng ================================ 4. termp。eratu.re a. denat。urati.on

常规是94。度5分钟， GC Rich的摸板是95。度5分钟

除了GC Rich外., 常规的APPLICA。TIONS。可以将这部。分时间缩短。到1到2分。钟， 或者在CY。CLE 1时给予较长的时间,而取消开始.的dena。turat.ion b. annea.ling

重点到了：一般情况下。, 是从55度。开始.根据情况配合以Mg离。子浓度进行调整。 有条件的可。以做gra。dient pcr。 退火的时间在30—60S， 时间短一些。可以得到更。好的效果. 因为， polym。erase 在 annea。ling temp.时也会有一些活性. 所以在A。T。的时间过长.， 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外，在对于一些。困难户， 比如从gD.NA里扩增。大片段， 还可使用t。wo step PCR. 5. touch。down PCR

原理很简单。，但的确是一个很有用的。方法。举个例子，ANNEA。LING TEMP. 55度 94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycl.es 94 30s 59 30s 72 1min 2cycl.es 94 30s 58 30s 72 1min 2cycl。es 94 30s 51 30s 72 1min 2cycl。es 94 30s 50 30s 72 1min 20cyc.les 72 5min

6。 hot start。 PCR

热启动PC。R是除了好。的引物设计之外，提高PCR。特异性最重。要的方法之。一。尽

管Taq DNA聚合。酶的最佳延。伸温度在7。2℃,聚合酶在室.温仍然有活。性。因此,在进行PC。R反应配制.过程中,以及在热循环刚开始，保温温度低。于退火温度.时会产生非特异性的产.物。这些非特异。性产物一旦.形成，就会被有效。扩增。在用于引物.设计的位点因为遗传元件的定位而受限时,如site.—directed突变。、表达克隆或。用于DNA工程的遗传元件的构建。和操作，热启动PC。R尤为有效。。

Taq. DNA聚合酶活性的常用方法是在。冰上配制P。CR反应液，并将其置于.预热的PCR仪。这种方法 简单便宜，但并不能完。成抑制酶的。活性，因此并不能。完全消除非特异性产物。的扩增。

热启动通过。抑制一种基.本成分延迟.DNA合成。，直到PCR。仪达到变性.温度。包括延缓加入Taq DNA聚合 酶,在反应体系达到90度时,PAUSE.，将温度保持.在70度以。上，手工加入p.olyme。rase，但这个方法. 过于烦琐， 尤其是对高。通量应用，并容易造成.污染。其他的热启.动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或。酶，包裹起来，或者将反应.成分,如模板和缓.冲液，物理地隔离.开。在热循环时， 因蜡熔化而把各种成分.释放出来并.混合在一起。有很多公司提供这样的酶。 =======================

ampli。wax PCR Gems (Perkin Elmer。)

Taq Bead Hot Start Polym。erase。 (Prome。ga） Magne。sium wax beads. （Strat。agene。）. =========================

象手动热启。动方法一样，蜡防护层法。比较烦琐，易于污染，不适用于于。高通量应用。。 还有一种方。法是使用i。nacti。ve DNA Polym.erase。. polym。erase。被抗体抑制.失活,当变性温度。超过70度。时，抗体也变性。了,这样pol。ymera.se又被激。活了。

7. Boost.er PCR

我们知道1。ug human. genom。ic DNA 大约在3X。10 5幂个模板.分子,这样的模板.分子数目可以是引物与.模板很好的结合. 当模板的浓.度过低,比如低于100个分子时， 引物和模板.之间就很难。发生反应. 引物容易自。身进行反应。形成二聚体。这样就有来。了个 boost。er PCR 我一直找不到合适的词.来翻译这个.booster。

具体是这样.的。开始几个c。ycles。保持pri.mer的低.浓度,保证pri。mer:templ.ate的m。olar ratio在10 7～ 10 8. 以确保开始。扩增的准确。性。然后boo。ste Primer的浓度到。正常的水平。

8. 循环数和长度

确定循环数.的基本原理.是: 产物能够保。证你进一步.分析操作的。最小循环数..因为过多的。循环数容易。造 成ERRO.RS和非特。异性产物的积累 产物的量不.够, 优化的方法有: 1。 增加TEMPLATE。 2。 增加循环数。

如何确定循。环数,有一个方法..

做一个PC。R体系,40循环，50ul， 分别在20.，25，30，35循环时从体系中取。5ul，一起跑电泳。分析。从而确定最佳的循环数。

另一个会影响PCR特。异性的是P。CR cycli。ng时在两。个温度间变。化的速率(rampi。ng rate）.当然是越高. 越好。不过咱们大部分条件有。限,就那么几台PCR仪,也没有多少。挑选的余地

9。 therm。al cycle。r

PCR仪的。因素我们经.常容易忽视。。长时间的使。用后需要调.整PCR仪.,以保证其能。够到达正确.的温度.现在的PC。R仪基本上都有自检功能（self—diagnosis）。

10. PCR additives

附加物或者。说enha.ncer实在是多种多样. 基本上包括。几类, 能够增加反.应退火效率.的化学因子。， DNA结合。蛋白和一些商业试剂. 基本的原理。不外是增加引物退火特.异性，减少错配, 增加产物的。长度和产量。.

在GC Rich情。况中， addit。ive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩.增的效率.而在另一种。情况下，addit。ive由于造成错配的prime。r-template复合。物的极大的。不稳定， 而提高了扩。增的忠实性.要注意的是。，没有万能的。enhan。cer全部通用，需要你根据.自己的情况,最好结合gradient pcr选择最优条件。

==================================================== dimet.hyl sulfo。xide(DMSO) up to 10％ forma。mide at 5％

trime。thyla。mmoni。um chlor。ide 10-100uM。 deter。gents. such as Tween. 20 0。1-2.5％ polyethyle。ne glyco。l （PEG)6000 5-15％ glyce.rol 10—15%

singl.e stran。ded DNA bindi.ng prote.ins Gene 32 prote。in 1nM

E。coli singl。e—stran。ded DNA bindi.ng protein 5uM 7 deaza.-dGTP（for GC rich） 150uM with 50uM dGTP Taq Exten.der （strat。agene)

Perfe.ct Match。 PCR Enhan。cer(strat。agene。) Q—solut.ion(Qiage.n）

====================================================

要注意的是。，DMSO，GLYCE。ROL等会。抑制pol。ymera.se的活性。,所以需要s.couti。ng出最适.的浓度

11。 Templ。ate DNA preparatio.n

提取DNA.时的试剂会抑制PCR反应的顺利。进行。因此需要对。TEMPL。ATE DNA进行。纯化.特别是SD。S(〈0。01％) 的情况下就.能强烈抑制。PCR的进.行. 可以加入一。些noni.onic

试。剂，如Twee。n， Nonid.， Triti。on之类的。反过来抑制SDS. 还有pro。teina。se K也要除干净, 不然会降解polym.erase。。

12。 Neste。d PCR

简单点说 设计两对引。物, 一对是长的， 一对是包含在长引物内.的, 用长引物扩。增的产物作.为第二次扩。增的模板，这样可以增。加产物的量。. 而且可以减少非特异性。带和错配的。情况。

增加PCR.的保真性

高保真酶

高温DNA POLYM。ERASE.是以单链D。NA或RN。A为模板，在dNTP.和一些阳离。子的存在情。况下，在特定的引。物指导下按。3'-5’方向合成D。NA。包括3种类型

a.5'-3'方向的DN.A合成能力，没有3'-5'方向的外切。酶特性.如Taq及。其突变体.这类酶的合成能力强，因为他不纠正合成中出。现的突变

b.与a类似，有合成活性.,没有3-5的外切活。性.但他们能以RNA为模板,合成DNA。 如Tth DNA Polym。erase。

c.有DNA聚。合活性，没有逆转录。活性，但有3-5方向的外。切酶活性.如pfu DNA Polym。erase。可以提高忠.实性。但是这些聚.合酶的产量.比Taq DNA聚合。酶低.

酶的混合物。

将Taq DNA聚合。酶同带有3。’到5’外切核酸酶。活性第二种。聚合酶混合。在一起可以.获得比单独.Taq DNA聚合。酶高的忠实性，并可以得到。高产量及扩。增长模板。

其他因素

除了酶,高浓度的d。NTP或镁。离子会降低。忠实性。将dNTP.的浓度从200μM降。低到25—50μM可。以增加精确.度如果四种.核苷的浓度。不同,忠实性会受。影响。进行较少的PCR循环。也会有助于。增加忠实性。，因为增加循环数目和产。物长度就会。增加突变可。能性。

1．简介

寡聚核苷酸.引物的选择。，通常是整个。扩增反应成.功的关键.所选的引物。序列将决定。PCR产物。的大小、位置、以及扩增区.域的Tm值这个和扩增.物产量有关。的重要物理。参数.好的引物设计可以避免。背景和非特.异产物的产.生,甚至在RNA—PCR中也。能识别cDNA或基因.组模板.引物设计也极大的影响。扩增产量：若使用设计粗糙的引物.，产物将很少甚至没有；而使用正确。设计的引物。得到的产物。量可接近于.反应指数期.的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进.行反应条件。的优化，比如调整M。g2+浓度,使用特殊的共溶剂如二。甲

基亚砜、甲酰胺和甘油.

计算机辅助.引物设计比。人工设计或随机选取更。有效。一些影响P.CR反应中。引物作用的.因素诸如溶。解温度、引物间可能.的同源性等，易于在计算。机软件中被编码和限定。。计算机的高。速度可完成.对引物位置。、长度以及适。应用户特殊。条件的其他.有关引物的变换可能性。的大量计算.。通过对成千种组合的检测，调整各项参.数，可提出适合。用户特殊实。验的引物。因此通过计。算机软件选。择的引物的总体“质量”(由用户在程.序参数中设。定）保证优于通。过人工导出.的引物。

需要指出的。是，引物不必与模板完全同.源,因此可包含。启动子序列.、酶识别。位点或5'端的各种修饰，这种对引物。的修饰不会妨碍PCR反应,而会在以后使用扩增子.时发挥作用.。

2．基本PCR引物设计参数

引物设计的。目的是在两.个目标间取.得平衡：扩增特异性。和扩增效率。特异性是指.发生错误引。发的频率。特异性不好。或劣等的引。物会产生额.外无关和不。想要的PC.R扩增子,在EB染色的琼脂糖凝。胶上可见到;引物效率是指在每一PCR循环中.一对引物扩。增的产物与.理论上成倍.增长量的接近程度。 ①引物长度；

特异性一般.通过引物长。度和退火温度控制.如果PCR的退火温度。设置在近于。引物Tm值.(引物/模板双链体。的解链温度。）几度的范围内，18到24。个碱基的寡核苷酸链是。有很好的序.列特异性的..引物越长,扩增退火时。被引发的模。板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低。于℃的最短的引。物，可获得最好.的效率和特。异性。

总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安.全性。每增加一个。核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用.的最短引物长度为18。个核苷酸.引物设计时.使合成的寡.核苷酸链(18～24聚物）适用于多种。实验条件仍不失为明智。之举。 ②引物的二级。结构

包括引物自。身二聚体、发卡结构、引物间二聚。体等。这些因素会影响引物和.模板的结合。从而影响引物效率。对于引物的。3’末端形成的.二聚体，应控制其ΔG大于—5.0kcal/mol或少。于三个连续。的碱基互补.，因为此种情。形的引物二。聚体有进一。步形成更稳。定结构的可。能性，引物中间或。5'端的要求可。适当放宽。引物自身形.成的发卡结.构，也以3’端或近3’端对引物—模板结合影.响更大；影响发卡结.构的稳定性。的因素除了.碱基互补配对的键能之.外，与茎环结构。形式亦有很。大的关系。应尽量避免。3’末端有发卡结构的引物.。 ③引物GC含.量和Tm值。

PCR引物.应该保持合.理的GC含.量。含有50%的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的T。m值大概在。56～62℃范围内，这可为有效。退火提供足够热度。一对引物的GC含量和。Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性。都较差，因为降低了。Tm值导致特异性的丧。失。这种情况下。引物Tm值。越高，其错误引发。的机率也越。大.若采用太高。的退火温度，Tm值低的引物对可能.完全不发挥作用.在从一批在。特定序列范。围内已合成。好的寡核苷。酸中选择一对新的引物。时,这种GC含量和Tm值.的协调非常。关键。一般来说,一对引物的.Tm值相差。尽量

不超过.2～3摄氏度，同时引物和。产物的Tm值也不要相.差太大，20摄氏度.范围内较好。 ④引物的额外。序列与退火温度

若有额外的.序列信息要。加到引物中.，例如T7R.NA聚合酶。结合位点、酶切位。点或者GC。发夹结构可。以使用加长。的引物。一般说来,引物5’端添加无关序列不会影.响引物特异。序列的退火。。有时候，引物中添加。了大量与模。板不配对的.碱基，可以在较低。退火温度的.条件下进行。4到5个扩增循环；然后在假定。引物5’端序列已经.加入到模板.中，计算得出的。退火温度下.进行其余的循环。

在引物上添加酶位.点时一个重.要的考虑是.大多数酶的有效切。割要求在它。们的识别序。列的5’端有2至3。个非特异的。额外碱基,这样就会增加引物的非.模板特异序列的长度。长引物序列。的另一个缺点是影响溶.解温度的精确计算，而这对于确。定PCR反应时的退火。温度又是必须的。对于低于20个碱基的.引物，Tm值可以。根据Tm=4（G+C)+2(A+T)计算。而对于较长.的引物,Tm值需要。考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PC。R引物设计。软件大多数.都采用这种.方式. ⑤引物的3’末端核苷酸.组成

引物3’末端和模板的碱基完全。配对对于获。得好的结果。是非常重要.的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少.如果3’末端的错配。过多，通过降低反应的退火温。度来补偿这种错配不会.有什么效果.，反应几乎注。定要失败。

引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。.应特别注意。引物不能互。补，尤其是在3.'末端.引物间的互。补将导致不想要的引物.双链体的出。现，这样获得的。PCR产物.其实是引物自身的扩增。。这将会在引.物双链体产物和天然模板之间产生。竞争PCR状态，从而影响扩.增成功.

引物3’末端的稳定。性由引物3。’末端的碱基。组成决定，一般考虑末。端5个碱基.的ΔG。此值的大小。对扩增有较。大的影响，负值大，则3’末端稳定性。高，扩增效率更。高,同时也更易。于异位引发。。

需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T.实验证明，以T结尾的。引物即使与。T， G或C错配。仍可有效延伸。

⑥PCR产物。的长度及在。耙序列内的。位置

所有的计算机程序都提。供对PCR.产物长度范。围的选择。一般说来，PCR产物.长度对扩增。效率有影响。。特定的应用。情况下，PCR产物.长度部分取.决于模板材.料。

预期产物的特定长度经。常取决于应.用的需要.若目的是建。立测定特异DNA片段.的临床检验.方法，120～300bp。的小DNA.扩增产物可能是最好的。.产物应具有.好的特异性和高的产生.效率,并含有能用.于探针捕捉杂交实验的.足够信息。这一长度范。围的产物可。以通过采用。两步扩增循环方法得到.，从而减少扩增时间。

其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如,通过定量的.RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足。够大以便构。成竞争性模板，这样，产物和竞争。物都能够在。凝胶上很容。易的分辨出.来.这些产物一。般在250。~750bp范围内。 ⑦补充说明

若在cDN.A序列内找。寻PCR引物，需特别注意。两点：首先,尽力将引物.和产物保持。

在mRNA。的编码区域.内，因为这是生.成蛋白质的。独特序列，不像3’末端非编码。区域与许多.其他mRN.A有同源性.；第二，尽力把引物。放在不同的.外显子上,以便使RN。A特异的P.CR产物与。从污染DN。A中产生的.产物在大小。上相区别.

若PCR的。目的是克隆。一个基因或。cDNA的。特异序列，产物的大小.是根据具体。应用预选的.。在这里，计算机程序.可以提供关于期望区域。侧翼选择引。物对的信息。 在选择用来.扩增来自不。同物种DN。A的引物时.,应避开mRNA的5’和3'末端非翻译。区序列，因为它们可。能没有任何.的同源性。

3．简并引物设。计

①设计简并引。物时，一定要检查.靶扩增区域选定氨基酸。遗传密码的。简并度。很显然，我们期望选.择简并度最.低的氨基酸。，达到提高特。异性的目的.

②充分注意物。种对于密码。子的偏好性。，选择该物种.使用频率高。的密码子，以降低引物。的简并性。

③应努力避免。3'末端的简并.,对于大多数。氨基酸残基.来说，意味着引物3’末端不要位。于密码子的。第三位。

④在一些多义。位置使用脱.氧次黄嘌呤。（dI)代替简并碱。基。

4． 测序引物设。计

当然，测序引物的。设计一般都.由测序公司来完成，如果需要自。己设计的话。;那么除了按。照上面所提。到的引物设。计通用标准。外，还需要注意。两点：

①测序引物的。特异性的标。准掌握应该。更严格一些。，也就是说设.计时更优先.考虑特异性。。因为在测序反应中，如果引物与.模板在非预。期位置退火。并引发链延。伸，会对结果对。来很大的干.扰甚至造成。结果无法识读。

②测序引物的。Tm值适当。高一些.现在大部分.测序反应均.选用耐热的。测序级DNA聚合酶来。催化，并采用PC。R的热循环.程序.选用的测序引物的Tm.值稍高一些。，有助于使反。应顺利跨过.待测模板的。二级结构区，也有助于降.低非特异反。应。

5． 探针的设计

探针的设计，根据不同的。用途各有其。设计特点，这里只是就通用的原则。进行讨论： ①探针的长短一般在20。—50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚.合酶合成错误,杂交时间长.。太短则特异性下降。

②注意G和C的含量努力.控制在40。-60％，同时一种碱。基连续重复。不超过4个。，以免非特异。性杂交产生.。

③探针自身序。列不能形成.二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上的.要求就要比。普通引物设。计严格得多。。

④如果探针地。靶目标是多。个基因的混。合物,就必须控制。该探针与无。关基因之间的相似性在.70%以下。

PCR中常见问题分析.与对策．

PCR产物。的电泳检测.时间

一般认为PCR产物应。在48h以内完成电泳检测，有些最好于。当日电泳检测,大于48h后带型就会。出现不规则。，甚至消失。