液基薄层细胞学技术联合免疫荧光染色在尿足细胞检测中的应用

液基薄层细胞学技术联合免疫荧光染色在尿足细胞检

∗

测中的应用

１００１９１）

·临床检验技术研究·

·１７３·

孙新平１，戴菊华１，张捷２（１．北京大学国际医院检验科，北京１０２２０６；２．北京大学第三医院检验科，北京

摘要：目的　观察液基薄层细胞学技术（ＴＣＴ）联合间接免疫荧光染色对尿液中足细胞的染色效果并探讨其临床应用价值。方法　收集５０例２型糖尿病肾病患者和１４例健康对照者晨尿标本，ＴＣＴ制片与传统离心涂片后均行间接免疫荧光染色，观察足细胞形态。结果　６４例标本中ＴＣＴ制片满意率（８５．９４％）高于传统离心涂片（５０．００％），ＴＣＴ制片的足细胞检出率（７３．４７％）高于传统离心涂片（５１．０２％），差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。２种方法检测足细胞均阳性时，ＴＣＴ制片的阅片效果优于传统离心涂片。结论　较传统离心涂片而言，ＴＣＴ制片联合间接免疫荧光染色在尿足细胞检测中具有优越性。关键词：液基薄层细胞学技术；传统离心涂片；间接免疫荧光染色；足细胞中图分类号：Ｒ４４６　　　　文献标志码：Ａ

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｉｎｐｒｅｐｌｉｑｕｉｄ⁃ｂａｓｅｄｃｙｔｏｌｏｇｉｃｔｅｓｔｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｕｒｉｎａｒｙｐｏｄｏｃｙｔｅｓ

ＳＵＮＸｉｎｐｉｎｇ１，ＤＡＩＪｕｈｕａ１，ＺＨＡＮＧＪｉｅ２（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，ＢｅｉｊｉｎｇＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｕｒｉｎａｒｙｐｏｄｏｃｙｔｅｓｂｙｔｈｉｎｐｒｅｐｌｉｑｕｉｄ⁃ｂａｓｅｄｃｙｔｏ⁃ｍｏｒｎｉｎｇｕｒｉｎｅｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍ５０ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙａｎｄ１４ｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓｗｅｒｅｓｍｅａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＴＣＴａｎｄｃｏｎ⁃ｖｅｎｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｍｏｒ⁃ｌｏｇｉｃｔｅｓｔ（ＴＣＴ）ｗｉｔｈｔｈａｔｂｙｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｓｍｅａｒｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅｐｈｏｌｏｇｙｏｆｐｏｄｏｃｙｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｆｏｒ６４ｕｒｉｎｅｓａｍｐｌｅｓ，ｔｈｅｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙｒａｔｅｏｆＴＣＴｓｍｅａｒｓ（８５．９４％）ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｓｍｅａｒｓ（５０．００％），ａｎｄｔｈｅｐｏｄｏｃｙｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＴＣＴｓｍｅａｒｓ（７３．４７％）ｗａｓａｌｓｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｅｆｆｅｃｔｏｆＴＣＴｓｍｅａｒｓｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｓｕｐｅｒｉｏｒｔｏｔｈａｔｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｓｍｅａｒｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅＴＣＴｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ⁃ｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｓｕｐｅｒｉｏｒｔｏｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｓｍｅａｒｍｅｔｈｏｄｉｎｔｈｅｐｏｄｏｃｙｔｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｕｒｉｎｅｓａｍｐｌｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｑｕｉｄ⁃ｂａｓｅｄｔｈｉｎｐｒｅｐｃｙｔｏｌｏｇｉｃｔｅｓｔ；ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｓｍｅａｒ；ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇ；ｐｏｄｏｃｙｔｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｓｍｅａｒｓ（５１．０２％）（Ｐ＜０．０５）．Ｗｈｅｎｕｒｉｎａｒｙｐｏｄｏｃｙｔｅｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｐａｔｉｅｎｔｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙｂｏｔｈｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅｒｅａｄｉｎｇ

１０２２０６；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＴｈｉｒｄＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９１，Ｃｈｉｎａ）

　　液基薄层细胞学技术（ｔｈｉｎ⁃ｐｒｅｐｌｉｑｕｉｄ⁃ｂａｓｅｄｃｙ⁃

的１型糖尿病患者出现微量清蛋白尿。

本研究选取２０１７年８月至２０１８年２月在北京大学国际医院已明确诊断为２型糖尿病肾病的住院患者５０例，其中男２６例，女２４例，年龄（４１．０±９．７）岁。１４例体检健康者作为健康人对照组，源自同期北京大学国际医院检验科工作人员，男８例，女６例，年龄（３３．３±４．９）岁，无既往疾病史，常规体检均无异常。研究对象性别、年龄差异均无统计学意义（Ｐ均＞０．０５）。

女性避开月经期，收集清洁中段晨尿１００ｍＬ，

ｔｏｌｏｇｙｔｅｓｔ，ＴＣＴ）已广泛应用于宫颈上皮内瘤变的诊胸腹水、脑脊液、气管刷片等中的应用仍在摸索阶段，还需进一步研究［１］。本研究用ＴＣＴ检测尿液标本足细胞，并与传统离心涂片比较，进而评价ＴＣＴ联合间接免疫荧光是否具有优越性。１　资料与方法

１．１　研究对象　根据ＮＫＦ⁃Ｋ／ＤＯＱＩ指南［２］，在糖尿病患者中，出现以下任何一条者考虑其肾脏损伤由病变伴有微量清蛋白尿；（３）１０年以上糖尿病病程

∗

糖尿病引起：（１）大量清蛋白尿；（２）糖尿病视网膜

断与筛查，其优越性得到国内外认可，但在如尿液、

按每个离心管各５０ｍＬ分装２份。本研究经北京大学国际医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

　　　　作者简介：孙新平，１９７８年生，男，主治医师，硕士，主要从事脱落细胞学形态检验工作。　　　　通信作者：张捷，主任医师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｊｍｕｚｈａｎｇｊｉｅ＠１６３．ｃｏｍ。

基金项目：北京大学国际医院中青年启动项目（ＹＮ２０１６ＱＮ１２）。

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１．２　主要仪器与试剂　ＢＤＰｒｅｐＳｔａｉｎＴＭ液基细胞自动制片仪及ＢＤＣｙｔｏＲｉｃｈＴＭ固定液（美国ＢＤ公司），ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｔｉｆｉｃ离心机（美国赛默飞世尔公司），ＬＥＩＣＡＤＭ２５００荧光显微镜（绿色荧光波长５８０ｎｍ）（德国徕卡公司），ＯＬＹＭＰＵＳＣＸ４１相差显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），小鼠抗人Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ（ＰＣＸ）单克隆抗体（一抗）（美国Ｒ＆Ｄ公司），ＦＩＴＣ荧光标记山羊抗小鼠ＩｇＧ（二抗）、４，６－二脒基－２－苯基吲哚（ＤＡＰＩ）染剂、１％胎牛血清清蛋白（ＢＳＡ）、０．２％Ｔｒｉ⁃１．３　标本处理Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司）。

ｔｏｎＸ⁃１００通透剂、无水乙醇、ＰＢＳ、甘油（北京１．３．１　传统离心涂片　将５０ｍＬ尿液标本按６００×ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，吹打混匀沉渣，取２０μＬ至尿沉渣计数板计数孔，用相差显微镜观察并计数各类细胞，初步了解沉渣中有无单个核细胞，如果相差显微镜观察尿沉渣正常，也无单个核细胞，则不再进一步作荧光检查。若有单个核细胞，用一次性吸管轻柔抽吸吹打标本，将沉淀物与液体混合均匀，吸取２０μＬ于洁净玻片上，用推拉法涂片，涂片后立即用９５％乙醇固定。

１．３．２　ＴＣＴ制片　将５０ｍＬ尿液标本按６００×ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，保留下层含细胞沉淀物，加入ＢＤＣｙｔｏＲｉｃｈＴＭ固定液，轻轻震荡后静置３０ｍｉｎ，二次震荡后转移到１２ｍＬ离心管内，再次离心（６００×ｇ５ｍｉｎ），弃上清液并充分震荡，放置到ＰｒｅｐＳｔａｔｉｎＴＭ全自动液基细胞制片机上制片，制片结束后取消玻片架，倒去沉降室内多余的酒精，移去玻片上的沉降室，迅速将玻片转移至无水乙醇中。

１．３．３　间接免疫荧光染色　将上述待染标本的载玻片以ＰＢＳ湿润，加５０μＬＴｒｉｔｏｎＸ⁃１００通透剂离心（６００×ｇ１０ｍｉｎ），弃上清液，加入１０ｍＬＰＢＳ，

１０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３遍，用与二抗相同宿主的ＢＳＡ封闭，室温孵育３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤３次，用一抗１∶２０稀释，４℃过夜，ＰＢＳ洗涤３次，用二抗１∶７５稀释，室温温育２ｈ，ＰＢＳ洗涤３次，用ＤＡＰＩ染核，甘油封片。

１．４　足细胞观察方法　采用双盲法阅片。每份标本低倍镜下观察全片，高倍镜下确认足细胞后摄像储存。然后选择全片左上、左下、右上、右下和中间５个不同位置共２０个高倍镜视野，记录完整的足细胞数量。同时评价制片满意度，以每张涂片细胞保存完整、形态清晰、上皮细胞数＞５０作为满意标准。每次实验均设ＰＢＳ代替一抗的阴性对照组。１．５　统计学分析　用ＳＰＳＳ２０．０统计软件进行。计数资料的比较用χ２检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２　结果

２．１　标本满意率　ＴＣＴ制片标本满意５５例，不满意９例，满意率８５．９４％（５５／６４）；传统离心涂片满意３２例，不满意３２例，满意率５０．００％（３２／６４）；ＴＣＴ（Ｐ＜０．０５）。

制片满意率高于传统离心涂片，差异有统计学意义

２．２　尿足细胞检出率　５０例２型糖尿病肾病患者晨尿标本，除１例镜检无单个核细胞外，其他４９例均符合进一步行荧光检查的要求。其中，用ＴＣＴ制片后行间接免疫荧光染色的标本共检测到足细胞阳性３６例，检出率７３．４７％（３６／４９），而传统离心涂片后再行间接免疫荧光染色的标本，有２５例为足细胞阳性，检出率５１．０２％（２５／４９），二者差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。见图１。１４例健康对照者尿液中均未检测出足细胞。

注，Ａ，传统离心涂片，未见足细胞；Ｂ，ＴＣＴ制片，箭头示ＰＣＸ单克隆抗体标记绿色荧光阳性的足细胞。

图１　同一患者晨尿的足细胞检出情况（×４００）

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２．３　阅片效果比较　同一患者２种制片方法ＰＣＸ均阳性时，ＴＣＴ制片的阅片效果明显优于传统离心涂片。用ＴＣＴ制片观察荧光染色的细胞形态特征：足细胞形态保持完整，呈星型多突状，胞体圆形或椭圆形，大小不一，整个细胞胞浆呈绿色荧光，强度＋＋～＋＋＋，ＤＡＰＩ复染核呈鲜红色，圆形、居中或稍偏一

侧，可见由胞体伸出的较多突起。背景干净清晰，细胞数量丰富，易于阅片。传统离心涂片检出的足细胞形态特征：足细胞完整性差，常与上皮细胞或大量细胞碎片及杂质重叠，且细胞内部结构模糊不清，胞浆绿色荧光强度＋～＋＋，涂片背景不洁，易导致漏检。见图２。

注：Ａ，传统离心涂片；Ｂ，ＴＣＴ制片。

图２　同一患者晨尿制片效果（×４００）

３　讨论

　　目前ＴＣＴ已广泛应用于宫颈肿瘤筛查和阴道微生物感染的诊断，并逐步扩展到细胞学检测的其他领域，如尿脱落细胞学。李建华等［３］总结ＴＣＴ的优越性：（１）脱落细胞收集方式，ＴＣＴ标本经离心沉淀后置于专用保存液中，细胞几乎１００％保留，收集的有效细胞成分多，提高了阳性率；（２）细胞保存液中含有固定剂、细胞分离提取剂等成分，不但可以除去尿液中大部分红细胞、炎性细胞及碎片等，背景较干净，还可以及时固定并保持尿液中细胞的原始形态结构。（３）制片过程采取自动程序化方式，制片速度快，减少了人为的干扰，提高了诊断的可靠性，靠细胞表面的张力均匀分布，与玻片形成稳固的结合，细胞单层平铺排列，保存完好，细胞核结构更清晰，易于观察；（４）ＴＣＴ制片的阅片面积缩小，不易产生视疲劳，减少漏诊，同时提高阳性率。

因尿液ＴＣＴ与传统制片标本的质量评估暂无统一标准，参照Ｏｒｄｏｎ等

［４］

要因素。关于足细胞和肾脏疾病的关系，大量研究表明尿足细胞可以反映肾小球疾病的严重程度，包括ＩｇＡ肾病、过敏性紫癜肾炎、糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化和活动性狼疮［６］，同时也有报道认为尿ＰＣＸ水平和糖尿病肾病、ＩｇＡ肾病等疾病活动度有关［７⁃９］。足细胞表达多种标志蛋白［１０⁃１１］，包括其内膜蛋白、表面蛋白、黏连分子、细胞骨架蛋白及转录因子等，如ｎｅｐｈｒｉｎ、ＣＤ２ＡＰ、ＺＯ⁃１、ｄｅｎｓｉｎ、ＰＣＸ、ＷＴ１、ＬＭＸ１Ｂ、ｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ和ｐｏｄｏｃｉｎ等，其中ＰＣＸ用于鉴别足细胞［１２］。

是主要的特异性标志蛋白，位于足细胞包膜顶端，表达数量最丰富且相对稳定，因此ＰＣＸ单克隆抗体常

在ＴＣＴ制片的基础上，有利于进一步行分子生

物学和免疫组织化学检查。ＴＣＴ制片联合免疫组织化学方法用于尿足细胞检测尚未见报道，这是本研究的创新点。ＴＣＴ制片与免疫组织化学相结合，对免疫组织化学染色几乎没有任何影响，有利于各种细胞的鉴别，且当需要重复制片及再次免疫组织化学标记时，不需再次采集标本，用保存液瓶中剩余的标本制片即可。我们前期建立了免疫细胞化学染色法检测尿液中足细胞的方法并初步应用于肾小球疾病的诊断［１３］，但足细胞数量和形态均欠佳。李惊子等［１４］用间接免疫荧光法以抗ＰＣＸ单克隆抗体对尿沉渣进行染色，证实尿沉渣中常见的红细胞、白细胞、上皮细胞等细胞成分都不染荧光，仅足细胞显现绿色荧光，核复染可显示完整细胞，表明该实验方法

准，２种制片方法的质量评估分为满意和不满意，每张涂片以保存完好、形态清晰、上皮细胞数＞５０作为满意标准。本研究中传统离心涂片的满意度率５０．００％，ＴＣＴ标本满意率为８５．９４％，差异有统计学意义（χ２＝４．６５５，Ｐ＝０．０３１）。

足细胞是肾小囊脏层上皮细胞，参与构成肾小球滤过屏障，足细胞的丢失是肾小球疾病进展的重

、李红全等

［５］

报道的标

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临床检验杂志２０１９年３月第３７卷第３期　ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉ，Ｍａｒ．２０１９，Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．３

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３７８⁃３８１．

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可用于检测尿足细胞。本实验在两者基础上，用ＴＣＴ对尿沉渣进行处理，结果显示较传统离心涂片的效果更优，因此值得推广，但尚需扩大样本以进一步验证其可靠性。４　参考文献

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胱癌诊断中的应用［Ｊ］．北京医学，２０１１，３３（７）：５６３⁃５６５．［２］胡仁明．糖尿病肾病的诊断和防治———中国糖尿病肾病诊断和

治疗的专家共识解读［Ｊ］．糖尿病临床，２０１５，８（９）：４４７⁃４５３．［３］李建华，付志民，吴广平，等．液基细胞学检测对非妇科细胞标本

对２型糖尿病肾病的诊断价值［Ｊ］．临床检验杂志，２０１６，３４（５）：

［９］ＳｈｅｎＰ，ＳｈｅｎＪ，ＬｉＷ，ｅｔａｌ．Ｕｒｉｎａｒｙｐｏｄｏｃｙｔｅｃａｎｂｅａｎｉｎｄｉｃａｔｏｒｆｏｒ

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与传统涂片在尿脱落细胞学检测中的对比研

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ｐｏｄｏｃｙｔｅｓａｎｄｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎｗｉｔｈｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｌｕｐｕｓｏｆｎｅｐｈｒｉｔｉｓ

ｕｒｉｎａｒｙ

［１２］ＥｃｏｎｏｍｏｕｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣＧ，ａｌｔｅｒｓＫｉｔｓｉｏｕｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅＰＶ，ＴｚｉｎｉａｏｆｐｏｄｏｃｙｔｅＡＫ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ

［１３］Ｓｃｉ，张春芝２００４，足细胞在肾小球疾病诊断中的初步应用，白雪丽１１７（Ｐｔｂａｓａｌｓｕｒｆａｃｅ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌ，孙新平１５）：，３２８１⁃３２９４．

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（（收稿日期本文编辑：２０１８⁃１０⁃１７：王海燕））

［４］Ｏｒｄｏｎ［５］［６］［７］Ｉｋｕｍａ