1.细胞基本操作

1. 细胞在培养基中，培养至对数生长期

2. 预先配置好冻存液：含20%血清培养基+10%DMSO+70%培养基（避免临时配置产热

伤害细胞）

3. 取对数生长期细胞，吸弃培养液

4. PBS润洗1-2次（放置培养基降低胰酶的消化能力）

5. 消化1-2min，至细胞不再贴壁，轻轻敲击培养皿，震落细胞 6. 加入适量冻存液，终止消化

7. 头吹打细胞悬液（106-5×106）至均匀

8. 加入1ml细胞于冻存管中，标记：细胞名称/冷冻时间/操作者等信息

9. 程序性降温：4℃10min，-20℃ 30min； -80℃ 16-18h, 液氮槽中长期存储 二、细胞复苏（快融）

1． 提前准备好水浴锅，水浴加热

2． 液氮中取出冷冻管，迅速投入至37-38℃水浴锅，使其在1min快速融化 3． 温育PBS/血清/抗生素等，37℃ 10-20min

4． 配制10%胎牛血清(1ml)+90%DMEM培养基（9ml）于培养皿中进行 5． 打开冻存管，小心倾倒至培养皿内，呈倒8字摇晃至均匀 6． 倒置显微镜观察细胞生长状况，细胞未贴壁。

7． 6-8h后，细胞贴壁，更换细胞培养基（去除冻存时DMSO）

另一种方法：复融后，加入10倍体积的培养液，1200r/min，4min离心去除DMSO，再加入培养基，培养细胞 三、细胞传代

1.37℃温育DMEM/血清/PBS等，10-20min 2.倒置显微镜观察细胞状态（是否长满？）

3.真空泵吸弃培养基，加入1mlPBS润洗细胞（清除DMEM，否则浪费胰酶） 4.加入1ml胰酶消化2-3min,CO2培养箱37℃

5.加入培养基终止消化，移液吹打至均匀（轻柔，否则细胞容易损伤） 6.按照需要传代（2-4皿），控制细胞密度不要太大，否则很容易又长满了。多余的可以真空泵吸弃

7.培养箱培养。一般2天换液 四、细胞换液

1、观察细胞状态，培养基颜色。吸弃原有培养基

2. 加入9mlDMEM+1ml胎牛血清（后加血清，转圈圈式轻柔加入，均匀不伤害细胞） 3.呈倒8字，混匀培养基即可 五、细胞铺板 （简易版） 1.吸弃培养基

2.PBS清洗2-3次，胰酶消化2-3min，DMEM，终止消化

3.收集消化后的细胞，加入1ml胰酶和4mlDMEM至离心管内。960r/mln,6min,封口膜封口 4.配置10倍稀释液（630ulPBS+70ul细胞液）1ml离心管。（稀释10倍）

5.吸弃OR倾倒离心后的培养基，重新加入5ml/10ml培养基，头反复吹打至细胞混匀 6.混匀后，吸70ul细胞液和PBS混和，吹打至均匀 7.细胞计数板细胞计数。计算细胞数量和密度

8.提前撰写好实验方案，根据现有细胞密度和实验所需细胞密度，进行调整。

同时计算好实验用血清/孔板/DMEM等情况， 例如：

总体积18ml 1个6孔板（每孔3ml） 现有细胞密度2×106 血清1.8ml 所需细胞密度2×104 铺板所需细胞总数 实验所需细胞密

细胞原液1.8ml 度×铺板总体积

/细胞原液密度 细胞原液180ul （总液）

9.进行铺板。

六、细胞计数板计数

1.将血球计数板及盖玻片擦拭干净，盖片盖在计数板上

2.10μ或者200μ（小刻度）吸出少量细胞悬液，滴加在盖玻片边缘，使细胞悬液充满在盖玻片和细胞计数板之间 3.静止3min

4.倒置显微镜下进行细胞计数（就是4个角上的4个大格子=4×16小格），4个大格子的细胞数除以4得每个大格子的（每个角）平均细胞数

细胞/ml=4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数（一般为10倍）

5.计数方法，数左不数右数上不数下，呈弓字型数。抱团细胞计1个细胞，超过10%细胞抱团，需要重悬细胞。 七、海院酶标仪使用方法 1.开机：密码1234

2.选择模板号，1号（MTT），建微板 3.放置96孔板，打开上盖 4.读出/取导出Excel,另存为

注：电脑上U盘勿动，为右侧显微镜的驱动装置 七、细胞实验中的注意事项

1. 取细胞实验无尘服，手套喷洒酒精 2.实验所需物品（头/离心管/等），从旁边的消毒柜取出，喷洒70-90%酒精，放置在超净工作台，紫外灯打开灭菌30min

2. 实验开始前，温育培养基/胎牛血清等至37℃水浴

3.紫外照明结束后，打开工作台鼓风和照明，喷洒酒精擦拭台面 4.真空泵的使用（吸弃培养基）：储液瓶内最初加入5-10ml 84消毒液，废液勿超过1/2,以免染菌。真空泵不锈钢针头，酒精灯外延灼烧灭菌

5．分装或者加液时，两个器皿之间勿接触，且需要酒精灯外焰灼烧瓶口，悬空不接触进行倾倒。

6.所有最好不要深入平皿内，如果要深入到平皿内要悬空不碰触皿壁。头放置过程中不要被外物接触，一旦碰触，就要抛弃

7.任何瓶口，头、玻璃等，需要酒精灯灼烧，所有操作均需在酒精灯外焰附近操作

8.手套及肘弯部在细胞皿打开的过程中，不要在其平面上掠过，要绕行避开，以防灰尘等落入皿内污染环境

9.所有操作及物品（头//打开的细胞皿等）不能离开操作台；操作者的肘弯部不能离开 10.取东西或者灼烧塑料开封等，灼烧镊子，至高温，烫开塑封口 11.500ml培养基中加入5ml的双抗

12.酒精灯酒精添加（95%，勿超过2/3,超净台外操作） 13.培养皿的取放（稳+尽量不接触皿壁内部等）

14.取新的培养皿时，要慢慢挤出来，不要把手伸进去 15.头吸液要慢，防止倒吸进入内。（尽量不要满量程使用）；头打液时，头悬空，不碰触液面和皿壁

16.结束后，收拾台面，擦拭超净台。然后紫外照射30-1h