酸性磷酸酯酶性质的探究及其固定化

中国海洋大学海洋生命学院 2011级生物化学与分子生物学

摘要：以紫贻贝消化腺为原料提取一种酸性磷酸酯酶(acid phosphatase，编号：EC 3.1.3.2)，进一步将原酶液盐析、透析、层析纯化，经SDS-PAGE电泳得到酶带。该酶水解对磷酸苯二钠最适pH值为4，最适温度为35℃，K+、 Mg+、 Na+、 Ca+四种金属离子都能促进酶活，其中，Ca+的促进作用较小。对该酶用两种方法固定化，活性炭吸附和海藻酸钠包埋，其中活性炭吸附后的酶最适温度基本保持不变，而海藻酸钠包埋后的酶最适温度有较大改变。

关键词：紫贻贝酸性磷酸酯酶性质固定化酸性磷酸酯酶

酸性磷酸酯酶(acid phosphatase，编号：EC 3.1.3.2)属于Ⅱ型非特异性磷酸单酯酶，酸性磷酸酶广泛存在于生物界，从低等生物大肠杆菌,酵母到高等动植物组织，体液以及人类肝脏、前列腺等都发现有酸性磷酸酯酶的存在。它与物质代谢关系密切，通过催化磷蛋白的水解,在细胞调节过程中起着重要的作用。本研究可以确定该酶的最适催化条件，并探究其固定化方法，对其发挥催化功能并大量生产应用具有一定的作用。 1.酸性磷酸酯酶的提取

酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，ACP）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。本课题选用紫贻贝消化腺中的酸性磷酸酯酶为材料，将买来的紫贻贝用过滤的海水饥饿处理4~8小时。戴上手套，将紫贻贝解剖后，观察其消化腺的位置，取下腺体与其周围组织，取紫贻贝消化腺，用滤纸吸干后称重142.5g，加入1倍体积预冷的缓冲液和石英砂在搅拌机中完全研成浆状。静置0.5h。继续4℃,4000rpm/min，离心10分钟。将离心管中大部分上清液倒入量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积114ml，然后倒入三角烧瓶中，做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”。计算粗酶液得率（mL/g）（粗酶液得率＝上清液体积/紫贻贝消化腺的重量）为78.46%。将原酶液精确三等分，一份进行梯度盐析提纯；一份放于冰箱内保存，用来做凝胶过滤层析（实验六）；一份用于酶固定化实验。 2.标准曲线的绘制

酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，ACP）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。本课题选用紫贻贝消化腺中的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：

由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。

根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验所采用的是Folin-酚法。

蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。

本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100

倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 2.1酶促反应进程曲线

所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明了酶促反应随反应时间变化的情况。 测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。

酸性磷酸酯酶酶液0.5ml 5 mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6) ，可用100 mmol／L磷酸苯二钠水溶液，用0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍。在以不同时间在11支管中加入0.5ml酶，于35℃恒温水浴锅中反应，加入5ml1mol/L碳酸

钠溶液终止反应，再加入Folin-酚稀溶液35℃下显色10min,测出吸光度，实验证明10min为最适反应时间。

2.2标准蛋白—G250标准曲线

考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。R250中的R代表Red，偏红，(C45H44N3O7S2Na ).R250属于慢染，脱色脱的完全，主要用于电泳染色G250中的G就是Green，偏绿(C47H48N3O7S2Na ).G250属于快染，脱色脱的不彻底，主要用于蛋白测定，比考马斯亮蓝R250多二个甲基.λmax=590―610nm.

准确称取牛血清清蛋白（BSA）10mg，溶于0.9%NaCl溶液100ml，即为配制成0.1mg/ml标准蛋白质溶液。取6支试管，加入一定比例的标准蛋白质溶液后，再依次加入0.9%NaCl溶液，最后加入G-2504ml,摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色。

2.3Folin-酚标准曲线

取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。按照表，向各试管中依次加入0.4mmol／L酚标准应用液、0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1mol／L碳酸钠溶液和Folin一酚试剂，摇匀，在35℃保温10min以上，以0号试管为空白，测定OD680nm下吸光度，以OD680为横坐标、酚标准应用液的毫升数为纵坐标作一条标准曲线。

3.酸性磷酸酯酶的纯化 3.1梯度盐析

粗酶液4℃,4000rpm/min离心10min,沉淀保留，上清液按35g/100ml的比例加入硫酸铵，于4℃冰箱中静置2h 。再一次4℃,4000rpm/min离心10min，沉淀保留。上清液按70g/100ml的比例加入硫酸铵，再一次4℃,4000rpm/min离心10min，沉淀保留，将上述三次沉淀合并，溶于适量缓冲液中。 3.2透析

透析袋是小孔径材料做成的,允许水分子通过而不允许其它大分子物质通过的袋子,所以它是可以重复使用的.方法: 把保存完好的袋子放在大量蒸馏水中漂洗3－5次。保存方法是4度（冰箱冷藏）蒸馏水浸泡，最好是重蒸水。

透析袋的预处理，把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。在使用之前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。

将上述盐析后的沉淀装到透析袋中，用夹子夹好后，放在缓冲液中置于磁力搅拌器上透析，一般透析2个小时，透析应置于低温下处理，透析时间应根据透析酶液的纯度要求合理选择。搅拌器速度适中。 3.3层析

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

根据酸性磷酸酶的分子量选择Sephadex G150。凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。

真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。再通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。收集带有光吸收的蛋白峰洗脱液，即为经凝胶过滤柱层析纯化的酸性磷酸酶。合并后得层析酶液。

3.5酶活测定

酶活力单位的定义为：在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(μmol)产物所需要的酶量规定为一个活力单位。用1号试管的A680在标准曲线上查出其对应的酚标准应用液的毫升数V，根据公式：2×0.4×V×1000/10可计算出lmL酶液中所含有的酶的活力。

比活力是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度,即指:单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数,一般用IU/mg蛋白质来表示.一般来说,酶的比活力越高,酶越纯.。

比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。 原酶液 透析后酶液 层析后原酶液 层析 盐析后酶液1 层析 盐析后酶液2 体积 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 活力单位 1.743 0.481 9.624 0.226 11.304 总活力单位 0.871 0.240 4.812 0.113 5.652 比活力 2.50 0.672 15.77 0.384 26.660 注：层析盐析后酶液2出现一个OD240nm的峰度值，蛋白含量也相对较高。后续实验过程中分别收取OD240nm的峰度值的样品（层析盐析后酶液2）和前一管样品（层析盐析后酶液1）。

4碱性磷酸酶SDS-PAGE电泳检测

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对pH和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳、双向电泳等类型。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）破坏氢键和疏水作用；巯基乙醇可打开二硫键，使多肽处于伸展状态，改变了蛋白质单体分子构象。此时SDS蛋白质复合物以相同的荷/质比向正极移动，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。由于凝胶的分子筛效应，电泳的迁移率与多肽链的分子量相关。

凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。用垂直电泳槽进行操作。

胶图分析：可以说本次试验中最失败的就是胶图，胶制备了两次才成功，样品刚开始无法下沉，Loadingbuffer配置也出现了问题。蛋白跑歪了，也没跑出去。

5.酸性磷酸酯酶的性质探究 5.1温度

由图可知，35摄氏度为酶的最适反应温度 5.2 PH

以下为配制不同缓冲液，调节PH后测定酶活

由图可知，ph为4左右为酶的最适ph。 5.3金属离子

以下为4种金属离子，分别为NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl对酶活性的影响。

由图可知，K+ Mg+ Na+三种金属离子都能促进酶活，相反，Ca+的促进作用较小。

6.酸性磷酸酯酶的固定化

活性炭交联固定。称取0.2g活性炭（经110℃活化0.5 h），倒入盛有8ml粗酶液的50 ml低温离心管中，间隙搅动，固定化处理10 min。然后7000 r/min低温离心10 min，沉淀活性炭即为固定化酶，上清液为固定化后的滤液。

海藻酸钠包埋固定。在20ml酶液中加入0.2g活性炭，缓慢搅拌半小时后，吸附4小时。再加入到100ml2%的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，用注射器滴入到1%的CaCl2溶液中， 制成直径3~4mm的固定化凝胶珠。放置在4摄氏度冰箱保藏。2×0.4×V×1000/10 原酶液 活性炭吸附后酶液 海藻酸钠包埋后酶液 体积 0.5ml 0.5ml 0.5ml 活力单位 1.743 1.616 1.886 总活力单位 0.871 0.808 0.943 比活力 2.50 2.65 7.03 固定化效率 1.06 2.812 固定化效率为酸性磷酸酯酶固定化后，在原酶上酶活性提高的效率，可以看出海藻酸钠包埋法对固定化酶的酶活有促进作用。 6.2酸性磷酸酯酶固定化酶性质的探究 温度——固定化酶作用

0.05 0

0204060-0.05

温度—活性炭吸 -0.1附后酶活

温度—海藻酸钠-0.15

包埋后酶活 -0.2

-0.25

-0.3

分析：活性炭吸附的固定化酸性磷酸酯酶的最适温度与未固定的酸性磷酸酯酶的差别不

大，都在35摄氏度左右。而海藻酸钠包埋后的酶最适温度有较大改变，由于测的温度范围不够大，所以无法看到海藻酸钠包埋后的酶最适温度。 7. 讨论与结果

酸性磷酸酯酶水解对磷酸苯二钠最适pH值为4，最适温度为35℃，K+、 Mg+、 Na+、 Ca+四种金属离子都能促进酶活，其中，Ca+的促进作用较小。对该酶用两种方法固定化，活性炭吸附和海藻酸钠包埋，其中活性炭吸附后的酶最适温度基本保持不变，而海藻酸钠包埋后的酶最适温度有较大改变。

固定化酶的形式多样，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产；或在反应器中进行批式搅拌反应；也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学；又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。现在又有人用酶膜（包括细胞、组织、微生物制成的膜）与电、光、热等敏感的元件组成一种装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息的传递及环境保护中有害物质的检测。固定化酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用，具有很大的优点，所以固定化方法的研究显得尤为重要。