酒精复合性肝纤维化大鼠模型的建立及动态观察

实验动物与比较医学　Laboratory Animal and Comparative Medicine

Ａｕｇ．２００８，２８（４）

酒精复合性肝纤维化大鼠模型的建立及动态观察

杨　　华１，　张丽军１，　冯艳玲１，　彭秀华１，　周文江１，２

（１．上海市公共卫生临床中心，上海　２０１５０８；２．复旦大学实验动物科学部，上海　２０００３２）［摘要］　　　　目的　　　　建立大鼠酒精复合性肝纤维化动物模型，观察肝纤维化的动态病变情况。方法　　　　雄性ＳＤ大鼠随机分成对照组、酒精性肝纤维化模型组。模型组大鼠灌胃酒精、橄榄油、吡唑的混悬液，并间断饲喂高脂饲料，　结合微量ＣＣｌ４腹腔注射的复合方式造模。分别于２、４、６、８周时检测造模大鼠血清丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）、天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）、胆固醇（ＴＣ）、甘油三酯（ＴＧ）水平，并根据肝脏病理切片分析肝脏纤维化病变程度。结果　　　在造模２周末，　肝细胞轻、中度脂肪变；４周末，重度脂肪肝，轻度的纤维组织增生；６周末，肝细胞严重脂变，纤维隔形成，中度界面肝炎；８周末，多个假小体形成，达早期肝硬化程度。模型组大鼠的体重、血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、ＴＣ水平与对照组比较，差异均有统计学意义。结论　　　　运用酒精灌胃为主的复合方式造模，８周内可建立形成不同程度（酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化）的酒精性肝纤维化的动物模型。该模型可靠且复制时间短，肝纤维化进展稳定。［关键词］　酒精；　ＣＣｌ４；　肝纤维化；　早期肝硬化

［中图分类号］　Ｑ９５－３３　　　　［文献标识码］　Ｂ　　　　［文章编号］　１００４－８４４８（２００８）０４－０２３４－０４

近年来，随着人民生活水平的不断提高，我国酒精性肝病的发病率逐渐增多，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病［１］。肝纤维化是酒精性肝病发展至肝硬化的必经阶段［２］，是治疗慢性肝病的关键环节［３］。因此，建立理想的肝纤维化动物模型，深入研究酒精性肝病的发病机制，筛选防治该病的有效药物，具有非常重要的意义。

以往肝纤维化动物模型多采用单因素制备，但周期长、成模率低，本实验采用酒精灌胃为主，结合微量ＣＣｌ４腹腔注射的复合方式造模，　通过跟踪检测其２￣８周的血脂水平的变化，并观察该模型的肝脏病理学的动态变化，为研究肝纤维化动物模型提供可靠的实验数据。

［收稿日期］　２００８－０２－１８

［基金项目］　中国肝炎防治基金会王宝恩肝纤维化研究基金课

　　　　　　题（２００７００２６）

［作者简介］　杨　　　华（１９７３－），　女，　畜牧师，　从事实验动物科研工作，　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｙａｎｇｈｕａ＠ｓｈａｐｈｃ．ｏｒｇ

［通讯作者］　周文江（１９６５－），　男，　副主任技师，　硕士生导师，　从事

　　　　　　　实验动物学的教学，　科研及管理工作，　　　　　　　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｗｊｚｈｏｕ＠ｓｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

１　　材料和方法

１．１　　　实验动物

ＳＰＦ级雄性ＳＤ大鼠４０只（１８０￣２００　ｇ），由上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供［ＳＣＸＫ（沪）２００３－０００２］。１．２　　　材料和试剂

无水乙醇、ＣＣｌ４购自国药集团化学试剂有限公司（本实验用６０％酒精由无水乙醇与蒸馏水稀释成）；　吡唑购自瑞典Ｆｌｕｃａ公司；　胆固醇、胆盐购自上海源聚生物科技有限公司；　橄榄油、猪油为市售；丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）、天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）、胆固醇（ＴＣ）、甘油三酯（ＴＧ）等试剂盒均购自上海科华生物科技股份有限公司。１．３　　饲料、药物的配制

酒精混悬液配方［４］：　６０％酒精（６￣１０　ｍｌ／ｋｇ・ｄ－１）、橄榄油（２　ｍｌ／ｋｇ・ｄ－１）、吡唑（２５　ｍｇ／ｋｇ・ｄ－１）混合物；　ＣＣｌ４橄榄油溶液配制［５］：　ＣＣｌ４：　橄榄油＝１∶３；　高脂饲料配方［６］：　８７．５％基础饲料＋２％胆固醇＋１０％猪油＋０．５％胆盐。１．４　　　实验方法

ＳＤ大鼠适应性饲养３　ｄ后随机分为２组，　（１）对

Ａｕｇ．２００８，２８（４）

实验动物与比较医学　Laboratory Animal and Comparative Medicine

　２３５

照组８只；　（２）酒精性复合性肝纤维化模型组（简称模型组）３２只。模型组大鼠酒精混悬液灌胃，　２次／ｄ，　早晚各一次。第１周６　ｍｌ／ｋｇ・ｄ－１，　第２周８　ｍｌ／ｋｇ・ｄ－１，第３周１０　ｍｌ／ｋｇ・ｄ－１，以后维持此量，直至造模８周末实验结束。另外第２周起按０．３　ｍｌ／ｋｇ・ｄ－１剂量腹腔注射微量ＣＣｌ４橄榄油溶液，２次／周；　同时隔周间断性饲喂高脂饲料。对照组大鼠给予基础饲料饲喂，等量的生理盐水灌胃干预，第２周起予以等量的生理盐水腹腔注射。１．５　　　处理方法

实验期间观察大鼠一般情况，包括精神状态、活动情况、皮毛光泽度、食量等；于造模２、４、６、８周末，　复合模型组各处死８只大鼠，　观察肝脏组织病理学变化，对照组于８周末处死。大鼠处死前禁食过夜，称重，　用戊巴比妥钠（３５　ｍｇ／ｋｇ）麻醉后，心脏无菌采血，制备血清，检测ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、ＴＣ指标。肝脏称重后作大体观察，再取肝左叶，用１０％甲醛固定，肝组织石蜡包埋切片，ＨＥ染色，光镜下行组织形态学观察。１．６　　　　统计学处理

－±所有数据均采用ｘ　ｓ表示，用ＳＰＳＳ１１．０统计

学软件进行两样本均数比较的ｔ检验。

型组大鼠体重增长缓慢，有的甚至呈负增长，与对照组比较有显著差异（Ｐ＜０．０１）（表１）。２．２　　　血脂以及肝功能变化情况

实验各时段及结束时，模型组血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、ＴＣ均高于正常组。第２周时，模型组血清ＡＬＴ与正常对照组比较有差异性（Ｐ＜０．０５），第４周起差异显著（Ｐ＜０．０１），并随实验时间延长逐步上升。模型组大鼠血清ＡＳＴ、ＴＧ与正常组比较，４周时无差异性，６周时ＴＧ有差异性（Ｐ＜０．０５），８周起有显著差异（Ｐ＜０．０１）。第４周时，模型组血清ＴＣ与对照组比较有显著差异（Ｐ＜０．０１），之后，ＴＣ水平维持相对稳定，各阶段之间无差异　（表２）。2.3肝脏组织学变化２．３．１　　　大鼠肝脏外观 对照组大鼠肝表面光滑，外观红褐色，质地软富弹性，肝边缘锐利（图１Ａ）。模型组大鼠肝脏色泽暗淡，呈土黄色，厚度增加，肝缘变钝，部分表面轻度桔皮样变，但油腻感不强，质地尚软（图１Ｂ）。

２．３．２　　　肝脏病理动态变化　　　对照组肝组织肝细胞大小形态正常，　肝细胞索排列整齐，以小叶静脉为中心呈放射状，肝窦清晰可见，肝细胞结构清晰，细胞核圆，位于细胞，胞质丰富，呈噬碱性（图２Ａ）。

第２周模型组肝组织肝细胞结构基本正常，肝组织表现为轻、中度脂肪变性（３０％左右肝细胞小泡状脂肪变），散在嗜酸变性，偶见点灶状坏死，汇管区结构基本正常（图２Ｂ、Ｃ）。

第４周模型组肝组织肝细胞脂肪变性加重，胞浆中脂滴空泡明显增多，　呈重度脂肪肝（７０％￣８０％的

２　　　结果

２．１　　　各组大鼠一般情况的比较

对照组大鼠灵活好动，反应敏捷，毛发光泽，饮食粪便正常，体重持续增加。酒精灌胃组大鼠出现毛发光泽度差、体态呆板、行动迟缓、精神萎靡、食欲减退等现象。造模第２周起，模

表　１　　实验期间各组大鼠体重的变化

组　　别

０周

　　　　　　２周

　　　　　　　４周３４１．２±１８．２

　　　　　　６周３９０．２±２３．１３１９．３±３１．６＊＊

　　　　　　　８周４０７．９±３８．０３１５．５±５６．６＊＊

对照组　　　　　　　　　　　　　　　　１８７．５±６．６　　　　　　　　　　　　　　　　　２８２．１±１２．５注：　与对照组比较，　＊＊Ｐ＜０．０１

模型组　　　　　　　　　　　　　　　　１８５．５±５．３　　　　　　　　　　　　　　　　　２４７．８±２２．２＊＊　　　　　　　　　　　　　　　　　　２７４．２±３４．８＊＊

表　２　　各组大鼠血清ＡＬＴ、ＡＳＴ　、ＴＧ、ＴＣ含量比较

组　　别　　　　　　　　　　　　　　　　　造模时间／周对照组模型组

　　８　　２　　４　　６　　８

　　　　　　　　ＡＬＴ／Ｕ・Ｌ－１　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＳＴ／Ｕ・Ｌ－１　　　　　　　　　　　　　　　　ＴＣ／ｍｍｏｌ・Ｌ－１　　　　　　　　　　　　　　　　ＴＧ／ｍｍｏｌ・Ｌ－１　　　　　　　　　３５．８±１０．５　　　　　　　　　５３．８±６．６＊　　　　　　　　　６５．６±１８．２＊＊　　　　　　　２０８．０±９０．８＊＊　　　　　　　２３８．０±１２０．０＊＊

１４９．５±２４．８　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．１８±０．１１６７．２±２７．２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．８７±０．０３＊１７２．２±３２．８　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．９５±０．２６＊＊３８４．８±８４．６＊＊　　　　　　　　　　　　　　　　　１．９８±０．０３＊＊８５５．３±４５２．５＊＊　　　　　　　　　　　　　　　１．９８±０．１＊＊

　　０．３２±０．１　　０．３６±０．０８　　０．４３±０．１７　　０．５２±０．１２＊　　０．６８±０．２＊＊

注：　与对照组比较，　＊Ｐ　＜０．０５，　＊＊Ｐ　＜０．０１

２３６

实验动物与比较医学　Laboratory Animal and Comparative Medicine

Ａｕｇ．２００８，２８（４）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ：　对照组　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｂ：　模型组

图　１　　大鼠肝脏外观

Ａ．　对照组　　肝细胞呈放射状排列　（ＨＥ　×１００）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｂ．　模型组２周　　小泡状脂肪变　（ＨＥ×４００）Ｃ．　模型组２周　　小泡状脂肪变　（ＨＥ×１００）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｄ．　模型组４周　　重度弥漫性脂肪变性　（ＨＥ×１００）Ｅ．　模型组４周　　汇管区小叶间胆管明显增生　（ＨＥ　×１００）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｆ．　模型组６周　　大泡状脂肪变及纤维增生　（ＨＥ　×１００）Ｇ．　模型组６周　　纤维化及灶状坏死　（ＨＥ　×１００）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｈ．　模型组８周　　假小叶形成，宽胶原带形成　（ＨＥ　×１００）Ｉ．　模型组８周　　炎细胞浸润，肝细胞部分坏死　（ＨＥ×１００）

图　２　　各组大鼠肝脏组织病理学改变

Ａｕｇ．２００８，２８（４）

实验动物与比较医学　Laboratory Animal and Comparative Medicine

　２３７

肝细胞大泡状混合小泡状脂肪变），嗜酸变性易见，肝细胞偶见点灶状坏死，汇管区扩大，淋巴细胞及少量中性粒细胞浸润，轻度纤维组织增生，偶见小叶间胆管轻度增生（图２Ｄ、Ｅ）。

第６周模型组肝组织肝细胞脂肪变性持续加重（８０％左右肝细胞大泡状脂肪变），嗜酸变性易见，肝细胞可见点灶状坏死，桥接坏死，呈中度界面肝炎。汇管区扩大，淋巴细胞及少量中性粒细胞浸润，纤维细胞向肝小叶内蔓延趋势，纤维间隔形成，有假小叶形成趋势，小叶间胆管明显增生（相当慢肝的ＣＨ－Ｇ２Ｓ２－３）（图２Ｆ、Ｇ）。

第８周模型组肝组织肝细胞脂肪变性逐渐减轻（２０％左右肝细胞微泡状脂肪变），散在嗜酸变性，点灶状坏死，少数区域肝界板破坏。汇管区小叶间胆管增生，炎细胞浸润进一步加重，纤维组织及胶原逐渐增粗，并向肝小叶内呈锋芒状蔓延，纤维间隔形成，多个假小叶形成，早期肝硬化表现（相当慢性肝炎ＣＨ－Ｇ２Ｓ４）（图２Ｈ、Ｉ　）。

３　　讨论

酒精性系列肝病已日益成为国内外研究的热点。乙醇及其代谢产物乙醛可引起肝细胞损伤，导致肝细胞脂肪变，产生脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化，甚至进一步发展为肝硬化。

对酒精性肝病的动物模型，国内研究者多采用酒精灌胃法［７，８］。周宁等［８］喂基础料，大鼠酒精灌胃２４周后观察到酒精性肝病病理改变，　而高脂饮食通过增加肝内脂肪含量促进酒精性肝纤维化的形成，　微量ＣＣｌ４联合酒精可以起到协同的作用［９－１１］。本实验参照以上文献并加以改进，在间断饲喂高脂饲料的同时，　用６０％酒精、橄榄油、吡唑的混悬液灌胃，　结合微量ＣＣｌ４腹腔注射的复合方式造模。以酒精为主导因素，用吡唑延缓酒精在肝内的代谢时间，以此造成较严重的酒精性肝损伤，以诱发肝纤维化的形成。

本实验表明，造模第２周起，模型组大鼠体重增长缓慢，呈负增长，与对照组比较有显著差异（Ｐ＜０．０１）。第４　周时，模型组血清ＡＬＴ、ＴＣ与对照组比较有显著差异（Ｐ＜０．０１），并随实验时间延长逐步上升。模型组大鼠血清ＡＳＴ、ＴＧ８周时与对照组比较有显著差异（Ｐ＜０．０１）。

造模的２周末，大鼠肝组织病理主要以肝细胞

的轻、中度脂肪变为主。４周末，大鼠肝组织病理肝细胞脂肪变性加重，胞浆中脂滴空泡明显增多，　呈重度脂肪肝，肝细胞重度脂变，同时有轻度的纤维组织增生。６周末，大鼠肝组织病理肝细胞脂肪变性持续加重，纤维隔形成，呈中度界面肝炎，有假小叶形成趋势，小叶间胆管明显增生。８周末，大鼠肝组织病理肝纤维组织及胶原逐渐增粗，并向肝小叶内呈锋芒状蔓延，纤维间隔形成，多个假小叶形成，为早期肝硬化表现。通过在光镜下对不同时期大鼠肝纤维化病理动态的观察，作者发现在８周内可完整复制大鼠由酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化逐渐演进的过程，明确了各阶段的发生时间，同时血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、ＴＣ也明显升高，　证实肝纤维化大鼠模型建立成功，可为肝纤维化的发生、发展等机制的研究提供了可靠实验依据。［参考文献］

［１］　许东升．　酒精性肝病发病机制的研究概况［Ｊ］．胃肠病学，

２００４，　９（１）：　４９－５１．

［２］　　　Ｆｒｉｅｄｍａｎ　ＳＬ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ

ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，　１９９３，　３２８：１８２８－１８３５．

［３］　　王宝恩．肝纤维化的诊断与严重度评估［Ｊ］．　中华肝脏病杂

志，　１９９８，　６（４）：　１９３－１９４．

［４］　　吴艳艳．　硫酸软骨素对大鼠酒精性肝纤维化模型的影响

［Ｊ］．　实用肝脏病杂志，　２００６，　２（９）：　２５－２８．

［５］　　王　　　磊．　大鼠酒精性肝纤维化复合模型的建立［Ｊ］．　中西医

结合学报．　２００６，　５（４）：　２８１－２８４．

［６］　　高志强，　陆付耳．　二甲双胍干预高脂饲养所致大鼠脂肪肝

的研究［Ｊ］．中华肝脏病杂志，　２００５，　２（１３）：　１０１－１０４．［７］　　周　　　宁，　厉有名，　张　　宇，　等．　大鼠酒精性肝纤维化模型的构

建［Ｊ］．　东南大学学报（医学版），　２００３，　２２（２）：　９３－９７．［８］　李东良，　王玉枚．　大鼠酒精性肝损伤模型的建立及病理学

观察［Ｊ］．　实用肝脏病杂志，　１９９８，　３（４）：　２０７－２０８．

［９］　　范建高，　曾民德．　脂肪肝与肝纤维化关系的实验观察［Ｊ］．　中

华医学杂志，　１９９８，　３（４）：　１９５－１９８．

［１０］　韩德伍，　马学惠，　赵元昌．　肝硬化动物模型的研究［Ｊ］．　山西

医药杂志，　１９７９，　４（１）：　１－４．

［１１］　Ａｕｇｕｓｔｙｎｉａｋ　Ａ，Ｗａｓｚｋｉｅｗｉｃｚ　Ｅ，Ｓｋｒｚｙｄｌｅｗｓｋａ　Ｅ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ

ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　ｔｅａ　ｆｒｏｍ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｇｅｄ　ｒａｔｓ　ｉｎｔｏｘｉｃａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｔｈａｎｏｌ［Ｊ］．　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２００５，　２１（９）：　９２５－９３２．

［１２］　欧　　　明．　汉英常用中医处方手册［Ｍ］．　广州：　广东科学技术

出版社，　１９９１．　２０８．