人CD48基因转染细胞株的构建

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人CD48基因转染细胞株的构建

1，2

田辛辛，葛

1

彦，袁

11111桦，蔡文治，杨鹏，蒋林华，殷丽丽，1131弛，孙雪薇，居颂文，居颂光

张

（1．苏州大学医学部基础医学与生物科学学院免疫学系，江苏苏州215123；2．南京市市级机关医院普内科，江苏

南京210018；3．江苏省人民医院肿瘤中心，江苏南京210029）

摘要：目的克隆人CD48基因，构建稳定表达CD48分子的基因转染细胞株。方法提取人外周血单个核细

PCR克隆获得人CD48基因，term，胞总RNA，通过RT-将人CD48基因重组入逆转录病毒载体pEGZ-通过293T细胞进而感染L929细胞，构建稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株。的包装获得具有感染力的完整重组病毒载体，结果

成功克隆人CD48基因和构建PGEZ/CD48逆转录病毒表达载体，进而成功获得稳定表达人CD48的基因转

成功克隆了人CD48基因及其逆转录表达载体，并构建了稳定表达CD48分子的基因转

染细胞株L/CD48。结论

染细胞株，为探讨CD48生物学功能的研究奠定了物质基础。

关键词：CD48；逆转录表达载体；基因转染细胞株中图分类号：R392．4

文献标识码：A

文章编号：1673－0399（2011）04－0527－04

ConstructionofHumanCD48GeneTransfectedCellLine

2TIANXin-xin1，，GEYan1，YUANHua1，CAIWen-zhi1，YANGPeng1，JIANGLin-hua1，LINLi-li1，

ZHANGChi1，SUNXue-wei1，JUSong-wen3，JUSong-guang1

（1．DeptofImmunology，SchoolofBiologyandBasicMedicalSciences，Medicalcollege，SoochowUniver-sity，JiangsuSuzhou215123China；2．DeptofGeneralInternalMedicine，NanjingGovernmentalHospital，JiangsuNanjing210018，China；3．CancerCenter，JiangsuProvinceHospital，JiangsuNanjing210029，China）

Abstract：Objective

ToclonehumanCD48geneandconstructgenetictransfectedcelllinethat

HumanCD48genewasclonedfromperipheralbloodmononulearcells

stablyexpressesCD48．Methods

andconsequentlysubclonedintoretroviralexpressingvectorpEGZ-term．Wholecombinatedretroviralexpressingvectorwasintegratedbypackagecell：293Tcell，thenCD48genetictransfectedcelllinewasconstructedbyinfectingL929cells．Results

CD48genewasclonedbyRT-PCRandsubclonedinto

CD48geneisclonedanditsretroviral

retroviralexpressingvectorpEGZ/CD48successfully．GenetictransfectedcelllineL/CD48thatstablyexpressingCD48wasestablishedsuccessfully．Conclusion

expressingvectorisconstructedsuccessfully．TransfectedcelllinethatexpressesCD48isestablishedsuc-cessfully．ItprovidesavaluabletooltostudyCD48biologicalfunctions．

Keywords：CD48；retroviralexpressingvector；genetictransfectedcellline

CD48属免疫球蛋白超家族成员，又称BLAST1和SLAMF2，其基因读码框（openreadingframe，

ORF）全长为732bp，编码产物为40～45kd的糖蛋linosi-白，通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidy-

）；“青蓝工程”“国家大学生实验创新计划”基金项目：国家自然基金青年科学基金项目资助（81000912资助项目（2010）；苏州大学资助项目（2010）收稿日期：2011－03－11

作者简介：田辛辛（1983－），女，江苏泗洪人，住院医师，医学硕士，研究方向为肿瘤免疫学。通讯作者：居颂光

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JOURNALOFSOOCHOWUNIVERSITYMEDICALSCIENCEEDITION2011；31（4）

tol，GPI）锚定的方式表达于活化淋巴细胞表面［1］。

+CD48的受体为CD244，表达于CD8T细胞和NK

上海）；293T细胞和L929细胞物工程有限公司，

由苏州大学医学部传代均购自美国ATCC公司，保存。1．21．2．1

方法

RT-PCR克隆人CD48基因

分离健康人外

细胞等。CD48通过与CD244相互作用参与调节NK细胞和CD8+T细胞的活化状态和功能状态

［2，3］

。诸多研究表明，CD48作用于CD244产生的

生物学效应在人和小鼠等不同种属之间细胞上不尽相同甚至相反；尚有研究表明，随着CD244在细胞表面表达强度的不同以及与CD48的交联（cross-CD48作用于CD244亦可能产talking）程度的差异，生不同的生物学效应

［4］

提取总RNA，根据CD48基因周血单个核细胞，

（GenBank：NM_001778．2）设计引物，PCR通过RT-克隆CD48基因。PCR条件为：预变性94℃3min，30个循环，变性98℃15s，复性和延伸68℃30s，最-后延伸68℃5min。所用引物如下：上游引物F：5’；下游引物R：5’-GAAGTTCTGGAAGGAAGC-3’TCATCTCAGGTAAGTAACAGG-3’。预期PCR产物长度755bp。1．2．2

重组逆转录病毒载体的构建

设计合成带

F：5’-ATT-有EcoRI酶切位点的上游引物：EcoRI-GAATTCATGTGCTCCAGAGGTTGGGATTCG-3’和带R：5’-有BamHⅠ酶切位点的下游引物BamHⅠ-，GGTGTGGATCCTCAGGTAAGTAACAGGCCAAG-3’以步骤1．2．1所获PCR产物为模板，采用高保真酶KOD酶通过PCR引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。PCR条件为：预变性94℃3min，变性98℃15s，复30个循环，最后延伸68℃5性和延伸68℃30s，

term载体，min。回收纯化的PCR产物和pEGZ-用EcoRI酶和BamHⅠ酶双酶切，酶切后的PCR产物term载体经切胶回收纯化、和pEGZ-采用T4DNA连转化DH5α感受态菌株。挑选克隆，煮接酶连接后，

菌PCR验证，测序正确的阳性重组克隆在LB培养液中扩增后，抽提质粒，命名为pEGZ/CD48，－80℃冻存备用。1．2．3

构建CD48基因转染细胞株

（1）细胞准

备：293T细胞用10%FCS的DMEM培养基培养和L929细胞用10%FCS的RPMI10培养基培养，适维持对数生长状态。（2）重组逆转录病毒时传代，

5

细胞丰度的制备：将1×10/ml细胞接种于6孔板，

。因此，CD48/CD244的确

切生物学效应及机制尚未完全阐明。另有研究表CD48/CD244与疾病的发生发展过程密切相关。明，

CD48/CD244信号在慢性乙型肝例如，有研究发现，

+

炎病理过程中可能抑制病毒特异性的CD8T细胞

的功能点

［6，7］

［5］

。而CD48在免疫功能低下和炎性病理过

程中起着重要作用，也可能是进行干预的重要靶

。因此，构建稳定表达CD48分子的基因转染细胞株对CD48/CD244生物学效应及其在病理过程中的作用和机制的研究具有重要意义。本文成功克隆了人CD48基因，构建了逆转录病毒表达载体以及稳定表达CD48的基因转染细胞株，现报道如下。11．1

材料与方法材料

健康人外周血采自苏州市红十字中心血站，DH5α菌株由复旦大学遗传所余龙教授惠赠；KOD酶（Toyobo，日本）；rTaq酶（Takara公司，大连）DNAMaker2000、EcoRI和BamHI性内切酶（Fer-mentas，T4连接酶购自日本TaKaRa公司；加拿大）、RT-PCR试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自上海生物工程公司；胎FCS）购自美国Hyclone公牛血清（fetalcalfserum，

司；RPMI10和DMEM基础培养基购自美国GIB-CO公司。逆转录病毒表达载体pEGZ-term（带有GFP基因序列）及两个辅助病毒载体pHIT456和pHIT60由德国Wuerzburg大学Sefling教授惠赠和授权使用

［8］

达85%～90%时，将pEGZ/CD48、辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后，采用脂质体法转染包装细胞：293T细胞，以获得具有感染能力的完整的CD48重组逆转录病毒。培养48h后，收集培养上清备用。（3）将重组病毒感染L929细胞：取步骤（2）中收集的含有重组逆转录病毒的上清0．5ml，加入含有10%FCS的RPMI10培养基0．5ml，同时按8

5

μg/ml添加Polybrane，按0．5×10/ml混悬L929细

；Zeocine（Invivogen公司，Lipo-美国）、

fectamine2000（Invitrogen公司，美国）和Polybrane（sigma公司，美国）；APC（别藻青蛋白）标记抗CD48单克隆抗体（克隆号MEM-102，AbDSerotec公司，英国）；PCR引物合成和基因测序（上海生工生

苏州大学学报（医学版）2011；31（4）

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胞，置于24孔培养板中培养。培养48h后，消化L929细胞并按1×104/ml重悬细胞，按1ml/孔接种于24孔板，按10μl/ml加入500μg/mlZeocine加压筛选，适时换液。待L929细胞长成细胞群落挑取单个克隆的部分细胞进行流式细胞术检后，

PCR验证基测；抽提基因转染细胞总RNA，采用RT-因转染细胞内CD48基因的存在和转录。上游引-GAAAAAGACTGGGAATGAGC-3’；下游引物：5’

-GTAAGTAACAGGCCAAGAATGG-3’。采用物：5’

rTaq酶，PCR条件为：预变性94℃5min，变性94℃45s，30个循环，复性56℃45s，延伸72℃1min，最后延伸72℃10min，预期产物为393bp。抽提pEGZ空载体包装病毒感染的L929细胞：L/mock以PCR阴性对照模板；及L929细胞的总RNA为RT-

以pEGZ/CD48重组质粒为PCR阳性对照模板。22．1

结果

成功获得正确人CD48基因，建立逆转录病毒以人外周血单个核细胞总RNA为模板，经RT-PCR扩增获得约750bp的基因片段（图1），通过PCR引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点后和载体pEGZ-term经酶切后重组，转化感受态DH5α菌株，抽提重组质粒，经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后释放出约750bp大小片段（图2），经分段双向DNA测序（测序图略），结果表明获得序列正确的人CD48基term表达载体，命名为因并成功地重组入pEGZ-pEGZ/CD48。

表达载体pEGZ/CD48

1：人CD48基因；M：DNAMarker图1

PCR电泳图人CD48基因RT-

M：DNAMarker；1：CD48基因；2：pEGZ/CD48重组质粒；3：EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pEGZ/CD48重组质粒图2

重组质粒pGEZ/CD48的电泳图及酶切图

2．2成功建立稳定表达CD48分子的基因转染细胞株

pHIT60和pHIT456在重组质粒pEGZ/CD48、

脂质体作用下导入293T细胞后，收集培养上清（含具有感染能力的完整的重组逆转录病毒）。将上述培养上清在24孔板培养孔中感染L929细胞48h后，2周后获得Zeocine抗性的采用Zeocine加压筛选，

L929细胞克隆。荧光显微镜下可见Zeocine抗性的

L929细胞表达绿荧光蛋白（图3）。采用鼠抗人CD48-APC直标单抗免疫荧光标记和流式细胞仪检测，显示L929细胞表达膜CD48（图4），命名稳定表达CD48的L929基因工程细胞株为L/CD48；抽提L/CD48细胞的mRNA，PCR获得相应大小的片经RT-段（图5）。L/CD48细胞经体外连续传代培养近半年仍可稳定表达膜CD48分子。及反复冻存和复苏，

Blank：L929细胞；IgGICtrl-APC：L/CD48细胞采用APC标记的鼠抗人IgGI同型对照染色；CD48-APC：L/CD48细胞

采用APC标记鼠抗人CD48单克隆抗体染色

图4

L/CD48细胞表达膜蛋白CD48的流式细胞术检测结果

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1：L/CD48；2：pEGZ/CDD48；M：DNAMarker；

图3

荧光显微镜下L/CD48细胞表达GFP蛋白（×200）

3：L/mock；4：L929

图5

PCR电泳图验证L/CD48细胞表达CD48基因的RT-

3讨论

CD48属免疫球蛋白超家族成员，通过GPI锚定

基因的完整病毒上清，进而感染小鼠成纤维细胞L929，通过Zeocine筛选获得稳定表达膜CD48的基因转染细胞株L/CD48。这为进一步研制抗人CD48单克隆抗体、探讨CD48的作用机制和靶向CD48分子的免疫干预奠定了基础。

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［1］

的方式表达于活化淋巴细胞表面

+

。CD48的受体

+

为CD244，表达于CD8T细胞和NK细胞等。通过CD48与244相互作用参与调节NK细胞和CD8T细胞的活化状态和功能状态

［2，3］

。诸多研究表明，

［4］

CD48作用于CD244的生物学效应因种属不同和CD244在细胞表面表达强度的差异而不同

。因

CD48/CD244的确切生物学效应及机制有待进此，

CD48/CD244与疾病的一步阐明。另有研究表明，

发生发展过程密切相关。例如，研究发现HBV（乙型肝炎病毒）慢性感染患者外周血和肝脏中病毒特

+

1异性CD8T细胞高水平共表达CD244分子和PD-

分子，进而发现CD244分子参与介导抑制信号，采用中和性抗体抑制CD244信号或阻断其配体CD48IFN-均可通过改变CD107a的表达、γ和TNF-α的

+

产生，促进病毒特异性CD8T的增殖能力和细胞毒

性。因而研究者认为，在针对病毒感染治疗中，CD48/CD244是于PD-1通路的新型干预靶点

［5，6］

。而另有研究表明，急性髓性白血病患者体

内CD48分子仅在1/4患者肿瘤细胞表达，我们认为CD48分子可作用于NK细胞表达的CD244分子参与NK细胞活化，肿瘤细胞表达CD48的减少可能导致了NK细胞活化抑制，从而参与肿瘤免疫逃逸这也提示了可以通过调节NK细胞活化受体机制，

及其配体进行抗白血病的免疫治疗。

PCR克隆获得的人CD48基因全本文通过RT-长ORF，鉴于CD48基因中带有锚定序列，因此将CD48基因直接重组逆转录病毒表达载体pEGZ-term，利用293T细胞作为包装细胞获得携带CD48

［责任编辑：肖丽娟］