Ki_67_NET_1与CD34免疫组化三重染色技术

Ki267、NET21与CD34免疫组化三重染色技术

王　平,董德平,张剑平,鄂　群,陈　莉

中图分类号:R392.31;R446.8　　文献标识码:B文章编号:1001-7399(2006)05-0618-01

　　目前,免疫组化一般采用在一张切片上显示一种抗原成分的单免疫组化方法,这对于某种肿瘤内多种抗原成分表达及相互关系研究来讲,一是操作繁琐、耗时,二是相互间比较时存在取材和操作的不同,使获得的结果不够客观准确,我们经多次实验,成功地在同一切片上完成了膀胱癌组织细胞Ki267、NET21及新生血管CD34免疫组化三重染色,为研究

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关键词:膀胱癌;三重染色技术;Ki267;NET21;CD340105%Tween20PBS冲洗3min×3次,滴加正常非免

疫动物血清,37℃孵育15min,倾去血清,不洗,滴加第三重

标记的一抗CD34(1∶100),37℃孵育60min;0105%Tween

20PBS冲洗3min×3次,滴加二抗,37℃孵育30min,0105%Tween20PBS冲洗3min×3次,滴加ACE显色液显

色,镜下阳性细胞呈桃红色为止;0105%Tween20PBS冲洗

3min×3次,水洗封固。2　结果

膀胱癌组织细胞中Ki267阳性定位于细胞核,染色呈蓝黑色。Net21阳性定位于细胞质,染色呈棕黄色。CD34阳性定位于新生的血管壁,呈桃红色。正常细胞呈蓝色,对比明显。

3　讨论

同一组织细胞内多种抗原表达及其相互关系提供了可靠的方法。

1　材料与方法

1.1　材料　43例膀胱癌标本均来源于南通大学附属海安

医院2000年1月～2005年1月手术患者,病史资料完整,均有临床和病理诊断。试剂购置北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2　方法　行4～5μm厚石蜡切片,常规脱蜡至水。将pH610柠檬酸缓冲液加热至沸腾,加入切片15min、流水冲洗、

　　以往,我们检测肿瘤细胞中的多种抗原均采用一张切片检测一种抗原,在进行相关性和对比研究中,很难判断在同一肿瘤细胞中是否同时表达两种或两种以上的抗原,因此在结果判断上就带有一定的主观性。随着免疫组化技术的不断发展,在同一组织切片上同时检测两种抗原,观察在同一个组织细胞中这些抗原表达的情况,并进行相关性和对比性研究,这种免疫组化双重染色法获得的结果更加客观可靠,优于以往连续相邻切片免疫组化单染色法。我们在此基础上,经过多次实验和研究,分别采用三种单克隆抗体作为一抗,同时检测膀胱癌中相应抗原的表达及预后情况,免疫组化染色结果对比清晰,色彩鲜艳,统计的结果也更为客观和准确。

在实验中为避免免疫组化多重染色时造成抗原抗体的交叉反应,我们在染色过程中采用SP法和EnVision两步法两种方法,在SP法中采用了ALP和POD两种酶系统,并通过借助不同的酶作用底物NBT/BCIP(ALP底物)、DAB和

AEC(POD底物)而获得不同的颜色(蓝黑色、棕黄色和桃红

蒸馏水浸泡2min×2次,3%H2O237℃孵育15min以消除内源性过氧化物酶,蒸馏水洗、PBS洗2min×3次。滴加胰蛋白酶消化液,37℃孵育10min,蒸馏水洗、PBS洗2min×3次。5%～10%正常非免疫动物血清,37℃孵育15min,倾

去血清,不洗。滴加一重标记的一抗Ki267(1∶50),37℃孵育60min,然后4℃过夜。0105%Tween20PBS冲洗3

min×3次,滴加二抗,37℃孵育30min,0105%Tween20PBS冲洗3min×3次,滴加链霉卵白素碱磷酶螯合物,37℃

孵育30min,0105%Tween20PBS冲洗3min×3次,滴加显色液显色,至镜下阳性细胞呈蓝黑色为止。0105%Tween20

PBS冲洗3min×3次,滴加增强剂,37℃孵育30min。0105%Tween20PBS冲洗3min×3次,滴加正常非免疫动

物血清,37℃孵育15min,倾去血清,不洗,加二重标记的一抗Net21(1∶400),37℃孵育60min。0105%Tween20PBS冲洗3min×3次,滴加二抗,37℃孵育30min,0105%

Tween20PBS冲洗3min×3次,滴加链霉卵白素辣根过氧

色)。同时在进行CD34抗原测定时采用EnVision两步法,将二抗与酶聚合物结合形成的多聚螯合物直接与一抗结合,没有使用链霉素抗生物素蛋白系统,因而避免了组织细胞内源性生物素所造成的背景染色,结果清晰、易于观察。由于组织切片要经过多重的免疫组化染色,并要经过加热处理,

容易发生脱片现象,因此要采用硅化或涂有黏附剂(多聚赖氨酸)的载玻片。

目前,我们正采用免疫组化三重染色技术,分别研究和检测Ki267、NET21和survivin等抗原在膀胱癌组织细胞中表达以及膀胱癌组织新生血管中CD34和CD105表达及其与预后之间的关系,实验结果令人满意。

化物酶螯合物,37℃孵育30min。滴加DAB显色液,镜下阳性细胞呈棕黄色为止。

收稿日期:2005-12-19　修回日期:2006-06-13基金项目:江苏省社会发展计划项目(NoBS2004527)作者单位:1南通大学附属海安医院泌尿外科,南通　226600

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南通大学基础医学院病理学教研室,南通　226000

作者简介:王　平(19-),男,主任医师。Tel:(0513)88086966