人CD34 +和CD34 -细胞在NOD／SCID小鼠体内的造血重建

生物工程学报　ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｒｎ．ａｃ．ｃｎ　ｃｊｂ＠ｉｍ．ａｃ．ｏｎ　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２００８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２５；２４（９）：１　５８８－１　５９４　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩＳＳＮ　１　０００－３０６１　＠２００８　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＡＳ＆ＣＳＭ，Ａｌｌ　ｒｉｇｈｔｓ　ｒｅｓｅｒｖｅｄ　人ＣＤ３４＋￣ｆ［１　ＣＤ３４－细胞在ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体内的造血重建　金慧丽，蔡海波，杨施，谭文松　华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海２００２３７　摘要：利用非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）小鼠模型，比较了新鲜及培养后的ＣＤ３４　和ＣＤ３４一细胞　在体内植入及重建造血能力。从新鲜脐血及培养后的单个核细胞（ＭＮＣ）中分离出ＣＤ３４　和ＣＤ３４一细胞，经尾静脉输注入　经亚致死剂量照射的ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体内，６周后处死存活的小鼠，取其骨髓、脾脏和外周血细胞，分别进行细胞表型　分析、造血集落形成单位和人特异性基因的检测。经检测，输注ＣＤ３４　细胞和混合细胞的小鼠，其体内ＣＤ４５　细胞及人　源各系血细胞的含量相近，两者均远远高于输注ＣＤ３４一细胞的小鼠。输注培养后ＣＤ３４一细胞的小鼠饲养６周后全部死亡，　输注培养后ＣＤ３４　细胞的小鼠存活率约为６６．７％，而输注培养后混合细胞的小鼠全部存活，且在两组存活的小鼠体内均　能检测到ＣＤ４５　细胞及人源各系血细胞。结果表明：无论是新鲜还是培养后的ＣＤ３４　细胞均具有在ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体　内植入和重建造血能力，而ＣＤ３４一细胞不具有该能力，但ＣＤ３４一细胞与ＣＤ３４　细胞同时输注有助于提高小鼠的存活率，　说明其对ＣＤ３４　细胞在小鼠体内发挥植入和造血重建能力有一定的辅助作用。　关键词：ＣＤ３４一细胞，ＣＤ３４　细胞，ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠，造血重建能力　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　Ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４＋Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ＣＤ３４一Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｎ０Ｄ／Ｓ　ＣＩＤ　Ｍｉｃｅ　Ｈｕｉｌｉ　Ｊｉｎ，Ｈａｉｂｏ　Ｃａｉ，Ｓｈｉ　Ｙａｎｇ，ａｎｄ　Ｗｅｎｓｏｎｇ　Ｔａｎ　Ｔｈｅ　Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＢｉｏｒｅａｃｔｏｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅａｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆＳｃｉｏｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２３７，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴＩ１ｅ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｅｓｈ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｆｕｒｅｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ＣＤ３４一ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｎｏｎｏｂｅｓｅ　ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｎ０Ｄ／ｓＣＩＤ）ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅ１．Ｆｒｅｓｈ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ＣＤ３４一ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｒｏｍ　ｆｆｒｅｓｈ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ．Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ＣＤ３４～ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｒｆｏｍ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ（ＭＮＣ）．　Ｗｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｈｅｓｅ　ｃｅｉｌｓ　ｉｎｔｏ　ｓｕｂｌｅｔｈａｌｌｙ　ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ　ｖｉａ　ｔｈｅ　ｔａｉｌ　ｖｅｉｎ　ａｎｄ　ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ　ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ａｆｔｅｒ　６　ｗｅｅｋｓ．　Ｔｈｅ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ．ｓｐｌｅｅｎ　ｎｄ　ｂｏｎｅ　ａｍａｌＴｏｗ　ｆｒｏｍ　ｅａｃｈ　ｍｏｕｓｅ　ｗｅｒｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ｆｏｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　Ａｌｕ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＣＤ４５　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ＮＯＤ／ＳＣ　Ｄ　ｍｉｃｅ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｓｅ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｂｏｔｈ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ＣＤ３４－ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｌｅ　ｉｔ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ＣＤ３４－ｃｅｌｌｓ．Ｓｉｘ　ｗｅｅｋｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｉｌ．ａｌｌ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＣＤ３４一ｃｅｌｌｓ　ｄｅａｄ．Ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｉｃｅｍ　ｉｎｉｅｃｔｅｄ　ｗｉｈｔ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　６６．７％．ＡＵ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂｏｔｈ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＣＤ３４一ａｎｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ｓｕｒｖｉｖｅｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ＣＤ４５　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ａｌｌ　ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ　ｍｉｃｅ，ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４，ＣＤ３，ＣＤｌ９，ＣＤ３３　ａｎｄ　ＣＤ７１　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｌｓｏ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｓｅ　ＣＤ４５　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｂｏｔｈ　ｆｌｅｓｈ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ｂｕｔ　ＣＤ３４一ｃｅｌｌｓ　ｈａｄｎ’ｔ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ＣＤ３４一ｃｅｌｌｓ　ｈａｄ　ａｓｓｉｓｔｎｔａ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：Ｊａｎｕａｒｙ　６，２００８；Ａｃｃｅｐｔｅｄ：Ｊｕｎｅ　３，２００８　ＳｕｐｐｏＳｅｄ　ｂｙ：ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｍｒ￣Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏ．２０７７６０４３）ａｎｄ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｎｏ．０７４３１９１０９）　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：Ｈａｉｂｏ　Ｃａｉ．Ｔｅｌ：＋８６—２１—６４２５３３９４；Ｆａｘ：＋８６—２１—６４２５２２５０；Ｅ—ｍａｉｌ：ｃａｉｈａｉｂｏ＠ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃａ　国家自然科学基金（Ｎｏ．２０７７６０４３）和上海市生物医药科技攻关项目（Ｎｏ．０７４３１９１０９）资助。　维普资讯 http://www.cqvip.com

金慧丽等：人ＣＤ３４　和ＣＤ３４一细胞在ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体内的造血重建　１５８９　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣＤ３４一ｃｅｌｌ，ＣＤ３４　ｃｅｌｌ，ＮＯＤ／ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ，ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　造血干细胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ，ＨＳＣ）是人　结果均在９５％以上。　体造血组织中能自我更新，又能分化产生各系血细　胞的一类细胞。ＣＤ３４抗原是人们普遍认同的造血干　１．２细胞因子　细胞因子均为人重组蛋白，酪氨酸激酶受体３　配基（Ｆｌｔ一３）、促血小板生成因子（ＴＰＯ）由，美国　Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司生产，购自联科生物技术有限公司；　／祖细胞的代表性表面标志…，它是一个高度糖基化　的Ｉ型跨膜糖蛋白，具有调节细胞粘附性的作用，　能促进细胞对骨髓基质的粘附＿２］。但也有研究表明，　某些能够在体内长期重建造血和免疫功能的造血　干细胞不仅缺少谱系特异性标志，也不表达ＣＤ３４　分子　】，推测在ＣＤ３４一细胞群体中，也可能存在造　血干／祖细胞。　造血干／祖细胞在恶性血液疾病、遗传性疾病、　重症免疫缺陷及肿瘤放化疗所致的造血功能低下等　领域具有广泛的用途。脐血因为其具有高含量的原　始干／祖细胞【６】，较低的移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）的　发生率　等优点，已经成为了一种备受关注的造血　干细胞来源　】。由于单份脐血中造血干／祖细胞数量　有限，只能满足儿童移植的需要，因此有必要通过　造血干／祖细胞的体外扩增来扩大其临床应用的范　围，并加快移植后造血和免疫系统的恢复【９］。有研究　认为经体外扩增后的造血干／祖细胞在生理功能上　会发生一些变化，体外培养环境会对造血干／祖细胞　的增殖、分化、归巢效率等方面产生一定的影响ＨＯ］，　这些问题直接影响了造血干／祖细胞移植的效果。　因此，本研究以ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠为模型，比较　了培养前后ＣＤ３４　细胞和ＣＤ３４一细胞在体内生理功　能上的差异，考察了ＣＤ３４一细胞在造血干／祖细胞移　植中的作用，为扩增后造血干／祖细胞应用于临床提　供技术支持。　１材料与方法　１．１脐血的采集和制备　脐血由上海国际和平妇婴保健院提供，脐血采　集量为５０～１２０　ｍＬ。用磷酸盐缓冲液１：１稀释新鲜脐　血，经１．０７７　ｇ／ｍＬ　Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心后收集ＭＮＣ，　洗涤备用。采用ＭｉｎｉＭＡＣＳ免疫磁性吸附柱分离装　置，用ＣＤ３４　细胞选择试剂盒（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ公　司）按其说明进行ＣＤ３４　细胞的分离与纯化ｕ”，采用　流式细胞术对分离得到的ＣＤ３４　细胞进行纯度分析，　干细胞生长因子（ＳＣＦ）购于北京军事医学科学院生　物工程研究所；白细胞介素３（ＩＬ一３）购于北京大学医　学院免疫学教研室；白细胞介素６（ＩＬ一６）购于北京　宝赛生物技术有限公司；粒一巨系集落刺激因子　（ＧＭ—ＣＳＦ）购于上海海济生物制药有限公司；粒系　集落刺激因子（Ｇ—ＣＳＦ）购于杭州九源基因工程有限　公司。　１．３细胞的体外培养　ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ公司）培养基添加２０％（Ｖ／Ｖ）的胎牛　血清（ＦＢＳ）、５ｘｌ０　ｍｏｌ／Ｌ　２－巯基乙醇，其中细胞因　子组合为：ＳＣＦ（５０　ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｉｔ一３（５０　ｎｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（２０　ｎｇ／ｍＬ）¨　。细胞培养在２４孔板中进行，每孔装２　ｍＬ　培养液，ＭＮＣ接种密度为１ｘｌＯ。个／ｍＬ，置于３７。ｃ、　５％ＣＯ２及饱和湿度的培养箱中培养。每４　ｄ半量稀　释换液１次，培养到第７天时，收获细胞，分离　ＣＤ３４　和ＣＤ３４一细胞，悬浮于ＩＭＤＭ培养基中，待注　射于小鼠体内。　１．４小鼠移植实验　实验小鼠为６周龄的ＮＯＤ／ＳＣＩＤ鼠，由中国科　学院上海实验动物中心提供。进行细胞移植前，对　小鼠进行２．７　Ｇｙ亚致死剂量的铯源照射。移植时，　将收获的细胞悬浮于０．３　ｍＬ的ＩＭＤＭ培养基中，经　尾静脉输注入小鼠体内，饲养６周后，取外周血、骨　髓和脾脏细胞做进一步检测。　１．５造血干／祖细胞集落检测　集落形成单位（ＣＦＣ）检测在含０．９％甲基纤维素　的ＩＭＤＭ半固体培养体系中进行，添加２０％的ＦＢＳ　以及ＳＣＦ（５０　ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ一３（２０　ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ一６（２０　ｎｇ／ｍＬ）、Ｇ—ＣＳＦ（２０　ｎｇ／ｍＬ）、ＧＭ—ＣＳＦ（１４　ｎｇ／ｍＬ）和　ＥＰＯ（２　ｕ／ｍＬ）。人血细胞以１．０ｘ１０　个／孔、小鼠细胞　以１．０￣１０　个／ＴＬ的密度接种于２４孔板中，每孔加　０．５　ｍＬ半固体培养基，然后置于３７。Ｃ、５％ＣＯ２及饱　和湿度的培养箱中，培养１４　ｄ后计数。　维普资讯 http://www.cqvip.com

１５９０　ＩＳＳＮ１０００・３０６１　ＣＮ１１・１９９８／Ｑ　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２５．２００８　Ｖｏ１．２４　Ｎｏ．９　１．６细胞表面抗原检测　流式细胞术检测存活小鼠骨髓和脾脏细胞的　ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４和ＣＤ７１阳性细　存活；４周后，输注ＣＤ３４一细胞的小鼠存活率为２５％，　输注ＣＤ３４　细胞和混合细胞的小鼠存活率为５０％；６　周后，单独注射ＣＤ３４　细胞和ＣＤ３４一细胞的小鼠存　活率均为２５％，注射混合细胞的小鼠存活率为　５０％。结果表明移植ＣＤ３４　、ＣＤ３４一混合细胞更有利　于小鼠的存活。　表１照射６周后ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠的存活数量　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ＮＯＤ，ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ　胞的含量，外周血的ＣＤ４５阳性细胞含量。抗体均为　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司产品，按产品说明书方法标记，标　记细胞用流式细胞仪（ＢＤ公司）分析，结果用　ＷｉｎＭＤＩ软件处理。　１．７聚合酶链反应（ＰＣＲ）法检测人特异的Ａｌｕ序列　提取小鼠骨髓细胞中的ＤＮＡ，进行人Ａｌｕ序列　的ＰＣＲ检测。ＰＣＲ检测人Ａｌｕ序列时以人外周血白　细胞基因组ＤＮＡ作为阳性对照，正常ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小　鼠细胞基因组ＤＮＡ作为阴性对照。Ａｌｕ序列引物Ｉ１　如下：ＰＩ（正义链）５＇－ＣＡＣ　ＣＴＧ　ＴＡＡ　ＴＣＣ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＴＴ．３　；Ｐ２（反义链）５＇－ＣＧＣ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＧＧＣ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＣＡ　３　，反应条件：９４。Ｃ预热４　ｍｉｎ，循环参数：　９４。Ｃ、１　ｍｉｎ变性，５５。Ｃ、４５　Ｓ退火，７２。Ｃ、１　ｍｉｎ延伸，　共２１个循环，７２。Ｃ延伸５　ｍｉｎ，扩增片段长为２２１　ｂｐ，　用２０　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳进行检测，以５Ｏ　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ为标准。　１．８统计学分析　实验数据以平均值±标准方差（ｍｅａｎ＋＿ＳＤ）表　示；采用ｔ检验分析数据的统计学差异，Ｐ＜０．０５表示　有显著性差异。　２结果　２．１　脐血中ＣＤ３４　和ＣＤ３４一细胞植入和重建造血　能力比较　将接受亚致死剂量照射的ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠分成　４组，每组４只。其中，对照组小鼠每只注射０．３　ｍＬ　ＩＭＤＭ培养基（Ｃｏｎｔｒｏ１）；实验１组小鼠每只注射　４ｘ１０　个新鲜分离的ＣＤ３４　细胞（Ｆｒｅｓｈ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ）；　实验２组小鼠每只注射５ｘ１０　个ＣＤ３４一细胞（Ｆｒｅｓｈ　ＣＤ３４一ｃｅｌｌｓ）；实验３组小鼠每只注射４×ｌ０　个ＣＤ３４　细胞和５ｘ１０　个ＣＤ３４一细胞（Ｆｒｅｓｈ　ｍｉｘｅｄ　ｃｅｌｌｓ）。接受　细胞移植的ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠于无特定病原体环境下　饲养６周，从小鼠存活率、体内植入和造血重建能　力３个方面比较了ＣＤ３４　细胞和ＣＤ３４一细胞生理功　能上的差异。　小鼠存活情况如表１所示，细胞移植２周后，对　照组小鼠全部死亡，单独注射ＣＤ３４一细胞的小鼠存　活率为５０％，输注ＣＤ３４　细胞和混合细胞的小鼠均　ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　６　ｗｅｅｋｓ　ＣＤ４５是人类白细胞特异性表面抗原，受体鼠　中ＣＤ４５　细胞的含量是表征人造血干／祖细胞在小鼠　体内移植效果的重要指标。为验证小鼠存活是移植　了人造血细胞的结果，检测了接受细胞移植６周后　的ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠骨髓、脾脏和外周血中ＣＤ４５　细　胞的百分含量，结果如表２所示。输注ＣＤ３４　和　ＣＤ３４一混合细胞的小鼠体内ＣＤ４５　细胞的含量与输　注ＣＤ３４　细胞的小鼠相近，而输注ＣＤ３４一细胞的小　鼠体内ＣＤ４５　细胞的含量远远低于前两组。　表２　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体内人源细胞的百分含量　Ｔａｂｌｅ　２　Ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｎｇｒａ￣ｍｅｎｔ　ｉｎ　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ　Ｔｈｅ　ｐｍｐｏ￣ｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＣＤ４５　ｃｅｌｌｓ（％）　ｓｐｌｅｅｎ　ＢｏｎｅｍａｌＴｏｗ　为了进一步探明人造血／祖细胞是否植入到　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体内，对小鼠的骨髓细胞进行了人　源特异性Ａｌｕ序列的检测。提取了所有存活　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠的骨髓细胞的ＤＮＡ进行ＰＣＲ分析，　结果如图１所示，对照组和输注ＣＤ３４　细胞的小鼠　骨髓细胞中没有检测出Ａｌｕ序列，而输注ＣＤ３４　细　胞和混合细胞的小鼠体内均能检测出长为２２１　ｂｐ的　Ａｌｕ序列。可见，仅注射ＣＤ３４　细胞的小鼠体内不存　在人源细胞，尽管流式细胞术检测到小鼠体内有少　量ＣＤ４５　细胞的，但是含量极低，仅为１％左右，推　测应该是检测系统误差所致，因此，认为ＣＤ３４一细　维普资讯 http://www.cqvip.com

金慧丽等：人CD34和’CD34细胞在NOD／SCID小鼠体内的造血重建1591胞在小鼠体内不具有植入能力。明CD34’细胞具有在体内重建造血的能力。，而CD34细胞则不具有这个能力SCIDNOD／322221bp表3Table3po小鼠骨髓中各系人源造血细胞的百分含量Thpu(％)eaeCOexpressionmoflingemarkersinthmeCD45’lationofbonearrowSCIDinNOD／ice(％)图1．SCID小NOD／1Theex鼠骨髓细胞中人源nAluq序列的表达inDNAmFigexpressioofhumanceAlullsoseuencestracteodfrmombonemarrowfNOD／SCIDluwmeic’el：cellsfdotheceiceiniec：ceteodwiththemsamevoIMDM：2：humancecordblollsolls；3mmllsfthewwiceinieesesctemdeithfreshCD34cells4：ceftheiceiniectediceithfrithfrhixdlls；5：cellsoftheiniectedhCD34cells为了考察植入的人脐血细胞在小鼠体内的多系造血重建能力，此外，对各实验组中存活的NOD／SCID，小鼠骨，检测了各组，NOD／SCID小鼠骨髓中髓和脾脏细胞集落形成能力进行了检测结果发现各系人源造血细胞的比例检测输注CD34，图2为采用流式细胞术移植CD34’细胞和混合细胞的小鼠其骨髓和脾脏，’细胞的小鼠骨髓中各系人源造血细CD34、细胞的CFC集落密度相近4)。，均远远高于移植CD34，CD34一胞含量的结果CD71其中CD3、、CDl9、、CD33和细胞的小鼠(见表进一步说明了’细胞可以祖细胞分别为造血干／。T细胞B细胞、髓在小鼠体内植入并分化成各系造血细胞细胞不具备支持小鼠恢复造血的能力表4NOD／SCIDCo。而CD34系和红系细胞的表面标记各组NOD／SCID小鼠骨髓中各系人源造血细胞3，小鼠骨髓和脾脏细胞的集落密度a含量的检测结果见表结果显示在各组存活的小。Table4lonyformtionofbonemmarrowandspleencells鼠体内均能检测到各系人源造血细胞输注CD34’inNoD，SCIDice细胞和输注CD34’、CD34混合细胞的小鼠骨髓一中各系人源造血细胞的含量相近，没有明显差异；而输注CD34细胞的小鼠骨髓中各系人源造血细胞的含量非常低，远远低于输注了CD34细胞的小鼠’，说色一至出莹台一O3％山5234％已一‰告至叫厶“山“。答2‘’0一0一，§鱼邑藿O”u0’雀。‘。一了2100，潮簟’U一。一b0一黟IO’100lO’10M’10’lO。100lO10lO’10000100ouseIgG1FITCCD45FITCCD45FITC0218％山乱n一1297％．l2％山叫一0，‘0U罐0熏山riUE皇鬯’。蛰．；：．󰀀。_、一10蕾’c_0I匿黛勇”U。_b。0d10鬣’O”10010’lO。lO。10100100lO。10010010’10“CD45FITCCD45FITCCD45FITC图2Fig．输注eaCD34gra’细胞的小鼠骨髓中各系人源造血细胞的百分含量tinbonemarrow2HumanmultilingeenftmenofNOD／SCIDmiceinjectedwithfreshCD34J’cellsimournals．．ac．cn维普资讯 http://www.cqvip.com

1592ISSNl0003061CNll1998／QChinJBiotechSeptember25．2008V0124．No9．22．培养后进CD34和CD34’细胞植入和造血重建’检测到的数据相近，说明培养后的CD34’细胞仍具’能力检测一有良好的体内植入能力，且CD34细胞对CD34细。步比较扩增后，CD34，和CD34细胞植入和’胞在体内的植入没有产生显著影响表5造血重建能力起始细胞果如图3，取3份脐血13．分别以单个核细胞为，按所述方法进行体外培养，实验结SCID小鼠的存活数量照射6周后NOD／ThenumTable5berofasurviv6alNOD／SCIDksmice所示。其中总细胞、CD34133．’细胞和集落、irradiatedfterwee形成细胞扩增倍数的均值分别为178．倍205．倍和倍。3025．表620NOD／SCID小Leve鼠体内人源细胞的百分含量enTable6lsofhumangraftmoentinNOD／SCID’miceTheproportion15．sfhumanCD45cells(％)SpleenBonemarrowPeripheralblood10．05’indicaterencesexcomperimpareentswgroupcusrehowed’acestatistically．significantdiffedithltudCD34llsfP金慧丽等：人ＣＤ３４　和ＣＤ３４一细胞住ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体内的造血重建　１５９３　表７　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠骨髓中各系人源造血细胞的百分含量（％）　Ｔａｂｌｅ　７　Ｔｈｅ　ＣＯ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｎｅａｇｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＣＤ４５　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｉｎ　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ（％）　通过对ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠骨髓和脾脏细胞体外造　血集落形成单位的检测，比较了两组ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小　鼠骨髓和脾脏细胞的集落形成能力，结果如表８所　示。移植培养后的ＣＤ３４　细胞和混合细胞的小鼠，其　骨髓和脾脏细胞都可以在体外形成集落，且两者的　集落密度相近，进一步证明了扩增后的ＣＤ３４　细胞　具有在小鼠体内重建多系造血的能力，且扩增后的　ＣＤ３４一细胞对ＣＤ３４　细胞在小鼠体内的重建造血没　有产生显著影响。　表８　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠骨髓和脾脏细胞的ＣＦＣ密度　Ｔａｂｌｅ　８　Ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ａｎｄ　ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ＮｏＤ，ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ　Ｃｏｌｏｎｉｅｓ／１　０　ｃｅｌｌｓ　Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　Ｓｐｌｅｅｎ　３讨论　目前，造血干细胞通常被认为是表达ＣＤ３４阳　性和各系阴性ｆ】剞，而近年来也有研究表明，存在　ＣＤ３４一Ｌｉｎ一的造血干细胞群体…ｊ，可能是更原始的　造血干细胞，关于ＣＤ３４　细胞前体的存在和本质问　题仍有待探讨。通过对新鲜脐血中ＣＤ３４　和ＣＤ３４一　细胞的生理功能的比较，可以看出新鲜分离的　ＣＤ３４　细胞能在ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体内植入，并且分　化成各系血细胞，在小鼠体内重建造血，而ＣＤ３４一　细胞不具备植入和重建造血能力。另外，当ＣＤ３４一　细胞与ＣＤ３４　细胞同时输入小鼠体内时，在小鼠体　内的植入和造血重建水平与ＣＤ３４　细胞相近，但　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠的存活率高于单独移植ＣＤ３４　细胞　的小鼠，这可能是由于ＣＤ３４　细胞在体内分化成各　系血细胞需要一定的时间，在细胞移植初期，ＣＤ３４一　细胞中较成熟的细胞可以在短时问内对支持小鼠存　活起到辅助作用，而小鼠的长期存活则取决于ＣＤ３４　细胞在体内的自我更新和分化能力。因此，虽然ＣＤ３４一　细胞自身不具备植入和重建造血能力，但对ＣＤ３４　细　胞在体内发挥生理功能具有一定的辅助作用。　考虑到经体外培养后的造血干／祖细胞的生物　学特性可能会发生一些变化，会影响其在体内的生　理功能『】Ⅲ，为此本试验还评价了培养后的ＣＤ３４　细　胞和ＣＤ３４一细胞在体内植入和造血重建能力。结果　发现培养的ＣＤ３４　细胞在体内仍然具有生理功能，　可成功植入小鼠体内并能分化成各系血细胞，实现　造血重建。同时移植培养后ＣＤ３４　细胞和ＣＤ３４一细　胞到小鼠体内，ＣＤ３４一细胞不影响ＣＤ３４　细胞在体内　的植入和重建造血能力，但能提高小鼠的存活率。　这与新鲜分离的细胞结果相一致。　可见，无论是新鲜分离还是培养的ＣＤ３４　细胞　均具有在ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠体内植入和重建造血能力，　而ＣＤ３４一细胞不具有该能力，但ＣＤ３４一细胞与ＣＤ３４　细胞同时输注有助于提高小鼠的存活率，说明其对　ＣＤ３４　细胞在小鼠体内发挥植入和造血重建能力有　一定的辅助作用。　ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ　［１】Ｙａｏ　ＣＬ，Ｃｈｕ　ＬＭ，Ｈｓｉｅｈ　ＴＢ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｅｘ　ｖｉｖｏ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ＣＯｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２００４，３２（８）：７２【卜７２７．　［２】Ｇｕｚｍａｎ　ＰＦ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ＭＧ　Ｍａｙａｎｉ　Ｈｌ　Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ．ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｅｌ１　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　Ａｒｃｈ　Ｍｅｄ　Ｒｅｓ，２００２，３３（２）：１０７－１１４．　［３］Ｆｏｒａｚ　Ｎ，Ｐｅｔｔｅｎｇｅｌｌ　Ｒ，ＭｃＧｕｃｋｉｎ　ＣＲ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｌｉｎｅａｇｅ・－ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｓｔｅｍ－ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｆｏｒ　ｅｘ　ｖｉｖｏ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｆｏｒ　ＬＴＣ—ＩＣ．　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２００４，２２（１）：１００－ｌ０８．　（４］Ｗａｎｇ　Ｊ，Ｋｉｍｕｒａ　Ｌ　Ａｓａｄａ　Ｒ，ｇｔ　ａ１．Ｓｃｉｄ—ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＣＯｒｄ　ｂｌｏｏｄ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ＣＤ３４一ｃｅｌｌｓ　ａｃｃｕｒｅｄ　ｂｙ　ｉｎｔｒａ—ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ，２００３．１０１（８１：２９２４－２９３１．　［５］Ｏｓａｗａ　Ｍ，Ｈａｎａｄａ　Ｋ，Ｈｍａｄａ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｌｙｍｐｈｏｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ＣＤ３４一ｌｏｗ／ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌ１．Ｓｃｉｅｎｃｅ．　１９９６，２７３（５２７２、：２４２－２４５．　［６］Ｎａｕｔａ　ＡＪ，Ｋｒｕｉｓｓｅｌｂｒｉｎｋ　ＡＢ，Ｌｕｒｖｉｎｋ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ　ｂｙ　ｃｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｅｃｏｎｄ　ｕｎｒｅｌａｔｅｄ　ＣＯｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｕｎｉｔ．Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２００５，３３（１０）：１２４９－１２５６．　维普资讯 http://www.cqvip.com

１５９４　ＩＳＳＮ１０００－３０６１　ＣＮ１１－－９９６／Ｑ　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２５．２００８　Ｖｏ１．２４　Ｎｏ．９　【７】Ｒｏｃｈａ　Ｖ’Ｃｏｒｎｉｓｈ　Ｊ，Ｓｉｅｖｅｒｓ　ＥＬ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｖｉｖｏ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｌｏｎｇ．ｔｅｒｍ　ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ（ｍｙｅｌｏｉｄ，Ｂ．　ｏｕｔｃｏｍｅｓ　ｏｆ　ｕｎｒｅｌａｔｅｄ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ａｎｄ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ＣＯｒｄ　ＮＫ，ａｎｄ　Ｔ）ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ鲫ｖｉｖｏ　ｅｘｐａｎｄｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｗｉｔｈ　ａｃｕｔｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ，ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４　ＣＯｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２０００。　２００１，９７（１０）：２９６２－２９７１．　２８（１２１：１４７０－１４８０．　【８】ｖａｎ　Ｈｅｎｓｂｅｒｇｅｎ　Ｙ，Ｓｃｈｉｐｐｅｒ　ＬＦ，Ｂｒａｎｄ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘ　ｖｉｖｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　【１２】Ｄａｎｅｔ　ＧＨ，Ｌｅｅ　Ｈｗ，Ｌｕｏｎｇｏ　ＪＬ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４＊ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅＨｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ　Ｐ０）　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ　ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ｉｎ　ａ　ＮＯＤＩＳＣＩＤ　ｍｏｕｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｅｘ　ｍｏｄｅ１．Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２００６，３４（７）：９４３－９５０．　ｖｉｖｏ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２００１．２９（１２）：１４６５－１４７３．　【９】ｌａｒｏｓｃａｋ　Ｊ，Ｇｏｌｔｒｙ　Ｋ，Ｓｍｉｔｈ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　［１３］Ｘｕ　ＭＪ，Ｔｓｕｊｉ　Ｋ，Ｕｅｄａ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ａｎｄ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ（ＵＣＢ）ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｅｘ　ｖｉｖｏ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｂｙ　ｍｎｒｉｎｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｅｘｐａｎｄｅｄ　ＵＣＢ　ｃｅｌｌｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａ　ｐｈａｓｅ　Ｉ　ｔｒｉａｌ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｏｒｔａ．ｇｏｎａｄ—ｍｅｓｏｎｅｐｈｒｏｓ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ．　ＡａｓｔｒｏｍＲｅｐｌｉｃｅｌｌ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０１（１２）：５０６１－５０６７．　Ｂｌｏｏ　１９９８，９２（６）：２０３２－２０４０．　【１０】Ｌａｗ　Ｐ，Ｔｒａｙｌｏｒ　Ｌ，Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ　ＤＪ．ｅｅｌｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　【１４］Ｃｉｖｉｎ　ＣＩ，Ａｌｍｅｉｄａ—Ｐｏｒａｄａ　Ｇ，Ｌｅｅ　ＭＪ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ，　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｐ１ａｎｔａｔｉｏｎ．　ｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂ１ｅ，　ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ　ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｉｇｈｌｙ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１９９９。３８（２１：４７－５２．ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｄｕｌｔ　ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｅｍ　ｃｅｉｌｓ　ｆｎ　ｖｉｖｏ．　【１　１】Ｋｏｂａｒｉ　Ｌ，Ｐｆｌｕｍｉｏ　Ｆ，Ｇｉａｒｒａｔａｎａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８８（１　１）：４１０２－４１０９．　（　建茹０Ｃ　蠡　（　篷雾；）（通奢　（　舅；）Ｃ嘏彝　０　歇秘（蟪取　袭雾０　馥翁　ｅ薅耘０ｅ　蠡◇Ｃ魄舅０Ｇ馥舅　Ｃ　妊乃（　豁）ｔ＇ｏ２易０Ｇ馥勇ｏ　逮翁　Ｃ邋岛０（礴戥ｉ）＝（堍翱　科学出版社科学出版中心生命科学分社新书推介　青装）ｉ　—　ｌｌｌ　进出口贸易、商检、司法、海关、工商行政管理等领域的专业人员使用，也可供大专院校有关专业的师生参考。　欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书（免邮费）　邮购地址：北京东黄城根北街１６号　科学出版社科学出版中心生命科学分社邮编：　１００７１７　联系人：阮芯　联系电话：０１０．６４０３４６２２（带传真）　更多精彩图书请登陆网站ｈｔｔｐ：ｌｌｗｗｗ．１ｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ．ｃａ　Ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ｉｔＣ．ｃｎ