２０１７年９月 １０ 第３８卷第１７期 Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｉｏｐｍｅｎｔ 食品硪究与开发 基础研究 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－６５２１．２０１７．１７．００３ 灵芝液体发酵产胞外多糖培养基的优化 钱磊。张志军 ，陈晓明，李淑芳，李凤美，刘建华 （天津市林业果树研究所，天津３００３８４） 摘要：采用摇瓶液体发酵法探讨了培养基组成对灵芝胞外多糖产量的影响。单因素和正交试验结果表明，摇瓶发 酵培养基的最佳配方为豆饼粉０．２％、蔗糖２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＦｅＳＯ ０．０５％、Ｖ ０．００５％，其中豆饼粉和蔗糖为显著性 因素。在此条件下，胞外多糖产量达２１３．９ｍｇ／１００ｍＬ。 关键词：灵芝；胞外多糖；培养基；４Ｌ４￣ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ＱＩＡＮ Ｌｅｉ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ－ｊｕｎ ，ＣＨＥＮ Ｘｉａｏ－ｍｉｎｇ，ＬＩ Ｓｈｕ－ｆａｎｇ，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｍｅｉ，ＬＩＵ Ｊｉａｎ—ｈｕａ （Ｔｉａｎｊｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｏｍｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００３８４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｅｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｏｒｍｕｌａ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ ０．２％，ｓｕｃｒｏｓｅ ２％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％，ＦｅＳＯ４ ０．０５％ａｎｄ ＶＢ ０．００５％，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅ ｒｅａｃｈｅｄ ２１３．９ ｍｇ／１００ ｍＬ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｅｉｄｕｍ；ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｍｅｄｉｕｍ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ 基金项目：天津市农业科学院院长基金（１６００９）；天津市林业果树研究所所长基金（ｓｚＪＪ２０１６Ｏ０５）；天津市科技重大专项与工程计划 项目（１５ＺＸＢＦＮＣ００２５０） 作者简介：钱磊（１９８２一），男（汉），助理研究员，博士，研究方向：食用菌生物化学与分子生物学。 通信作者：张志军（１９６９一），男（汉），研究员，本科，研究方向：食用菌栽培与加工。 ●１ ●Ｉ●ｉＩ ４ｔ－Ｉ．．ｑｐ－ｉＩＩＱ－ ◆ ●［ＩＩ◆ ●Ｊ ◆…●， ●…●’ ｌ●ｔ，Ｌ ｉ ，参考文献： ［１］王福海，黄成华．活性氧自由基的研究进展【Ｊ】．广州化工，２０１３， ４１ ｒ１６１：１０—１２ ［９］铁梅，李宝瑞，邢志强，等．富硒大豆中蛋白提取工艺优化及 ＨＰＬＣ—ＭＳ联用测定硒代蛋氨酸【Ｊ】．食品科学，２０１５，３６（８）：６一ｌ１ ［１０］Ａｂｄｕｌａｈ Ｒ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋ，Ｎａｋａｚａｗａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｓｅｌｅ— ｎｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，ｌ９（２）：１４１－１５０ ［２］李旭．茶多酚的抗自由基作用ｆＪ】．科技视界，２０１４（２５）：３５２—３５３ 『３３］ 李云．综述自由基对人体健康的影响及目前的预防措施［Ｊ１＿内蒙 古石油化工，２０１ １，３７（１）：８７—８９ ［１１］黄开勋，刘琼，徐辉碧．硒蛋白的抗氧化性研究与第２１个氨基酸 的发现【Ｊ］．无机化学学报，２００８，２４（８）：１２１４—１２１６ ［４】张丽，陈冠华，方柔，等．毛细管电泳法测定过氧化氢酶与天然抗 氧化剂协同清除羟自由基作用【Ｊ１．分析化学，２０１３，４１（１０）：１５７１— １５７６ 【１２］胡振瀛，史卿，熊华，等．富硒及普通菜籽粕蛋白的抗氧化作用比 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组成对胞外多糖产量的影响，经正交试验优化确定摇 瓶发酵培养基最佳配方，旨在为灵芝多糖的工业化生 产提供理论依据。 １材料与方法 １．１材料与试剂 １．１．１菌株 灵芝Ｇ９：天津市林业果树研究所保藏。 １．１．２培养基 斜面培养基：马铃薯汁２０％，葡萄糖２％，琼脂２％， ｐＨ５．５。 种子培养基：马铃薯汁２０％，葡萄糖２％，ＫＨ２ＰＯ ０．２％，ＭｇＳＯ４ ０．１％，ｐＨ ５．５。 发酵基础培养基：葡萄糖２％，酵母粉０．２％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％，ＭｇＳＯ４０．１％，ｐＨ ５．５。 １．２仪器与设备 电子天平（ＢＳ２２４Ｓ型）：北京赛多利斯仪器系统有 限公司；酸度计（ＰＨＳ一３Ｃ型）：上海精密科学仪器有限 公司；卧式恒温摇床（ＨＮＹ一２１ １Ｃ型）：天津欧诺仪器股 份有限公司；紫外可见分光光度计（ＴＵ一１８１０型）：北京 普析通用仪器有限责任公司；高速冷冻离心机（ＧＬ一 ２０Ｃ型）：上海安亭科学仪器厂；电热恒温水浴锅（ＤＫ一 ３２０Ｓ型）：上海精宏实验设备有限公司；电热恒温鼓风 干燥箱（ＤＨＧ一９０３０Ａ型）：上海一恒科技有限公司；旋 转蒸发仪（Ｒ２０６Ｂ型）：上海申生科技有限公司。 １．３方法 １．３．１培养方法 菌种活化：从保藏菌种斜面中切取０．５ ｃｍ 大小的 菌丝块，接入斜面培养基，２８℃培养６ ｄ。 种子培养：将已活化的斜面菌种切成１ ｃｍ 大小 的菌丝块，接人装有１５０ ｍＬ种子培养基的５００ ｍＬ三 角瓶中，２８ ｏＣ、１５０ ｒ／ｍｉｎ培养５ ｄ。 发酵培养：将种子以１０％接种量接入装有１５０ ｍＬ 发酵培养基的５００ ｍＬ三角瓶中，２８ ｏＣ、１５０ ｒ／ｍｉｎ培养 ６ ｄ。 １．３．２胞外多糖的测定［・５１ 取２０ｍＬ发酵液，４０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清， 加入３倍体积的无水乙醇，４℃静置１２ ｈ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心２０ ｍｉｎ，收集沉淀，置于电热恒温鼓风干燥箱中， ６０℃烘干至恒重，即胞外多糖。 １．３－３单因素试验 氮源：以２％葡萄糖为碳源，分别以０．２％的酵母 粉、蛋白胨、棉籽饼粉、豆饼粉、玉米浆、麸皮、硝酸铵、 氯化铵为氮源，考察不同氮源对胞外多糖产量的影响。 碳源：以０．２％豆饼粉为氮源，分别以２％的葡萄 糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉为碳源， 考察不同碳源对胞外多糖产量的影响。 无机盐：以０．２％豆饼粉为氮源、２％蔗糖为碳源， 分别以０．１％的ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＣａＣ１２、 ＺｎＣ１ 为无机盐，考察不同无机盐对胞外多糖产量的 影响。 生长因子：以０．２％豆饼粉为氮源、２％蔗糖为碳 源、０．１％ＫＨ２ＰＯ 和０．１％ＦｅＳＯ 为无机盐，考察不同 浓度Ｖ ．对灵芝胞外多糖产量的影响。 １．３．４正交试验 在单因素试验结果基础上，选择豆饼粉、蔗糖、 ＦｅＳＯ 、ＫＨ２价指标，设计无交，ＰＯ 、ＶＢ为考察因素，以胞外多糖产量为评 互作用的正交试验表Ｌ。 （４５），研究 各因素及其水平对胞外多糖产量的影响，正交试验因 素水平见表１。 表１正交试验因素水平表 Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ２结果与分析 ２．１氮源的影响 以２％葡萄糖为碳源，考察不同氮源对胞外多糖 产量的影响，结果见图１。 钱磊，等：灵芝液体发酵产胞外多糖培养基的优化 基础研究 １２ 鲁 ０ 宝 昌 、＜ 皿唧 钿 ．Ｌ 电＼ 碧 不同的小写字母表示处理间差异达０．０５显著水平。 图１不同氦源对胞外多糖产量的影响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ０ｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆ１ ８＿【／ｓ吡）＼卿知 鲫印∞加∞∞∞∞加０ ｒ．．．．．Ｌ，．，．．．＿。．．．． ．．．．．．Ｐ．．．．．Ｌｒ．．． ． ．．．．． ｒ．．．．．Ｌ ●■■■■■Ｉ●■■■■Ｉ一 ■■■■■■Ｉ●■■●●Ｉ●■■Ｉ一 ●■■■Ｉ●■■Ｉ一 不同的小写字母表不处理ｌ司差异达０．０５显著水平。 图３不同无机盐对胞外多糖产量的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏＩｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ＣａＣ１ 、ＺｎＣ１：和ＭｎＳＯ ，胞外多糖产量显著降低，表明 ＣａＣ１：、ＺｎＣ１：和ＭｎＳＯ 对胞外多糖合成有抑制作用；而 ＭｇＳＯ 对胞外多糖合成无显著影响。因此，选择ＫＨ２ＰＯ 和ＦｅＳＯ 为培养基的无机盐。 ２＿４生长因子的影响 以０．２％豆饼粉为氮源、２％蔗糖为碳源、０．１％ ＫＨ２ＰＯ 和０．１％ＦｅＳＯ 为无机盐，考察不同浓度Ｖ 对 胞外多糖产量的影响，结果见图４。 ０ １９０ ０ １８０ １７０ 扣 １６ｏ 基础研究 钱磊，等：灵芝液体发酵产胞外多糖培养基的优化 表２正交试验结果与分析 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ 试验号 因素 胞外多糖／ Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ （ｒａｇ／１００ ｍＬ） 表３正交试验方差分析 Ｔａｂｌｅ ３ Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ 注：Ｆ一（３，３）－－９．２８０，Ｆ ｔ（３，３）＝２９．５００； 显著差异（Ｐ＜Ｏ．０５）， 极显 著差异（Ｒ０．０１）。 从直观分析（表２）可知，ＲＡ＞Ｒ ＞ＲＤ＞ＲＥ＞Ｒｃ，表明豆 饼粉对胞外多糖产量的影响最大，蔗糖次之，其它依 次是ＦｅＳＯ４、Ｖ¨ＫＨ２ＰＯ 。从方差分析（表３）可知，影响 胞外多糖产量的各因素显著性次序为豆饼粉＞蔗糖＞ ＦｅＳＯ ＞Ｖ ＞ＫＨ２ＰＯ ，其中豆饼粉和蔗糖均有显著性 ．影响。 通过正交试验获得摇瓶发酵培养基的最优配方 为Ａ２Ｂ：Ｃ２Ｄ。Ｅ，，但在正交设计表中并没有该组合的试 验，为此，我们按此组合补充试验，在此条件下，胞外多 ｌ ３＝＝Ｉ 糖产量达２１３．９ ｍｇ／１００ ｍＬ。综合以上试验结果，确定 摇瓶发酵培养基的最佳配方为豆饼粉０．２％、蔗糖２％、 ＫＨ２ＰＯ４ Ｏ．１％、ＦｅＳＯ４ ０．０５％、ＶＢ０．００５％。 ．３结论 本研究通过单因素试验探讨了培养基组成（氮 源、碳源、无机盐和生长因子）对灵芝液体发酵胞外多 糖产量的影响，经正交试验优化确定摇瓶发酵培养基 的最佳配方为豆饼粉Ｏ．２％、蔗糖２％、ＫＨ２ＰＯ ０．１％、 ＦｅＳＯ ０．０５％、ＶＢ．０．００５％，在Ｊ比务 ，２８℃、１５０ｄｍｉｎ培 养６ ｄ，胞外多糖产量达２１３．９ ｍｇ／１００ ｍＬ。 参考文献： 【１】宋频然，常继东．灵芝胞外多糖高产菌株筛选及其深层发酵培 养基的优化［Ｊ】．食用菌学报，２００３，ｌＯ（２）：９－１６ 【２］王慧杰，李字伟，连瑞丽，等．灵芝多糖液体发酵条件优化 ．食 用菌学报，２００７，１４（１）：３７—４２ 【３】 肖雷，姚菁华，吕兆启．优化发酵条件提高灵芝多糖产率的研究 ［Ｊ】＿食品科技，２００７，３２（８）：１２６—１２９ 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