光合细菌培养技术

一、 绪言 1、 生命起源

46亿 年前地球诞生时是炽热、混沌的，一切元素都呈气体状态，没有生命。最初的生命是地球温度下降以后，在极其漫长的时间里，由非生命物质经过复杂的化学变化过 程，逐步演变而成的。那时候，地球上火山内部喷发出来的气体中含有甲烷、氨、氢、硫化氢等，在大自然不断产生的宇宙射线、闪电的作用下，合成了氨基酸、核 苷酸、单糖等一系列简单的有机小分子物质，它们经过长期积累,相互作用,在适当条件下，就形成了原始的蛋白分子和核酸分子。又经过漫长时间的演化，38-35亿年前，终于形成了具有原始新陈代谢和能够进行繁殖的原始生命-古细菌。

地球出现原始生命后，又经过几十亿年的进化逐步形成了今天丰富多彩的生物界，大致可分为三大类：植物界、动物界和微生物界。所谓微生物是指一类个体微 小，结构简单，肉眼无法看到的微小生物。它们有细菌、真菌、放线菌、螺旋体、立克次体、衣原体、支原体、病毒等种类。广泛存在于空气、海洋和陆地中，繁殖 快，分布广，种类多。十七世纪，显微镜发明家虎克（hoek）首次在水中发现了微小生物-细菌，从此揭开微生物界神秘的面纱。

细菌属于原核生物，没有完整的细胞核，它由细胞壁、细胞膜、细胞质和核区组成，有的还有鞭毛，鞭毛是细菌的运动器官.细胞大小约为1微米-10微米.细菌分三大类：种类最多的杆菌、数目最多的球菌及纤细活泼的螺旋菌。

细胞壁位于菌体的最外层，具有一定的弹性和坚韧性，它对细胞有支持和保护作用。其化学成份一般为多糖、蛋白质和脂类。

细胞膜是介于细胞壁和细胞质之间一层极薄的膜，成分主要是蛋白质、脂类。它使细胞能保持相对的稳定性，维持正常的生命活动，具有渗透性，在酶的作用下，能选择性地让一些小分子物质进入或排出，与细菌的新陈代谢密切相关。

细胞质是细胞膜以内的原生质，为透明胶状物。主要包括基质和细胞器。

核区是不完整的细胞核，是组成核物质集中的区域，是核糖体、脱氧核糖核酸等遗传物质贮存和复制的场所。

2、 光合细菌概述

光合细菌(Photo Synthetic Bacteria 简称：PSB)属 细菌中的一类，有紫硫菌、绿硫菌、紫色非硫细菌和绿色非硫细菌。这里，我们将主要介绍紫色非细菌，它们是兼性厌氧菌，属原核生物界，光能异养型原核生物 门，红色光合细菌纲，红螺菌目，红螺菌科，红假单胞菌属，主要有荚膜红、沼泽红、球形菌、深红红螺菌等种类。菌体外形有螺旋状、短杆状、近于球形和球形 的。一般规格：长×宽＝1微米-3.2微米×0.6微米-0.8微米,球形菌直径0.8微米-1.5微米。它们以光和热为能源，主要利用有机物中的碳，同化其它营养进行元素进行生长繁殖，是高营养、高效能、多用途的有益微生物。 3、 光合细菌用途

光合细菌生命力、适应性都很强，在生长繁殖过程中能分解有机物和吸收水体中的氨态氮、硫化氢、亚盐等有害物质，本身无毒无污染。它在光照厌氧条件下 生长旺盛，在无光黑暗通气条件下亦能生长，但不合成红色素，易经诱导产生广泛的适应酶，对降解某些有毒或人工合成化合物具有潜力；耐低温（即使冰冻也不会 死亡）和高盐度（20%），适合处理高浓度有机废水，是优良的水环境改良剂。 光合细菌菌体营养丰富，含蛋白质(60%以上)，维生素B12、叶酸、核黄素、类胡罗卜素、辅酶Q10等促长因子和生理活性物质，是优良的饲料添加剂。

光合细菌以土壤接受的光和热为能源，将有机和无机营养物质转化成易为植物吸收的小分子物质。同时光合细菌除本身的有机营养物质外，还含有铜、锌、钼、钴、镍等微量元素，含量适中，施用后，可补充土壤所缺，提高肥效，是优良的植物肥料。 4、 光合细菌应用 （1）.养殖业

我国是养殖大国，近年来，养殖业取得了很大的发展。但是，传统的水产和畜禽养殖成本高，产量小，效益低，特别是养殖中使用的各种消毒剂和抗生素,即 破坏养殖环境，污染水产品，又增加养殖成本。如何有效地克服上述缺点呢？光合细菌作为优良的水环境改良剂和饲料添加剂，用于养殖业在我国才是近几年的事， 由于最早使用光合细菌的用户，取得了很好的效果和较大的经济效益，因此目前倍受推崇，大有普及之势。那么，光合细菌究竟起到什么样的作用呢？ ① 净化水质

由于高密度水产养殖的水体中，含有大量的鱼类粪便和残饵，以及鱼药的残留物，它们后产生的有害物质直接污染水体和底泥。轻度污染可造成鱼类生活不 适，饲料系数增高，生长缓慢，免疫力下降；积累到一定程度后，能使鱼类中毒、发病甚至死亡。这是由于有害物质，除直接危害鱼类外，同时也是病原微生物的营 养源，并使之大量繁殖，使鱼类染发病。兼性厌氧的光合细菌能改善水质的主要原因，是它在分解有机质时不产生有害物质，并且还能利用有害物质作为营养源，长 成自已的有益细胞，变害为宝；形成优势群落后，还能竞争性地抑制病原微生物的生长，降低感染机率。从而净化水质使鱼类健康生长。 ② 维持微生态平衡

养殖的水体中存在着各种各样的微生物，有的是有益的；有的是有害的；有的处于中间状态，叫\"条件致病微生物\"，即正常情况下，这类微生物不致病，但在水质恶化，鱼类免疫力下降时，便大量繁殖危害鱼类。自然界中，有害微生物和条件致病微生物都叫\"病原微生物\"是不可排除的，广义上讲，它们有利于生物进化。它们能使一些不健康的、免疫力低或退化了的生物体被淘汰。但是，无论是有害微生物还是条件致病微生物，必须在水体中达到一定浓度才能危害鱼类，这个浓度叫\"发病临界点\"。 不同种或不同体质的鱼，发病临界点不一定相同。在渔业生产中，控制病原微生物的浓度，使其达不到发病临界点，是健康养殖的关键。通常人们采用消毒杀菌剂来 控制，但随着施用次数的增加，病原微生物的耐药性亦相应增强，为了达到预防效果，施用剂量逐步加大，这不仅增加了用药成本，还污染了水体，造成水产品品质 下降，甚至不能食用。同时鱼类易产生应激反应，停食、消瘦，浪费有限的生长期。到了鱼类发病需要治疗的时候，安全剂量治不了病，大剂量施用又危及鱼类，这 个矛盾制约了水产业的发展。

如何控制病原微生物的生长繁殖，并使其不产生耐药性呢？光合细菌可基本克服消毒杀菌剂的缺点，它通过降解或清除水体中包括鱼药在内的有害化学物质；与病 原微生物争夺营养、空间，使其无法大量繁殖，从而不易形成致病的环境条件。假如由于病原微生物的原因，鱼类发了病，说明它在水体中的浓度已达到或超过发病 临界点，在微生物群体中占优势，此时，再用光合细菌治疗是没有明显效果的.须用消毒杀菌剂治疗,6-7天后,再施用光合细菌保养水质。

鱼类病害防治原则是：防重于治。只有在日常渔业生产中，维持水体微生态平衡，使有益微生物始终占绝对优势，才是健康养殖的出路。如果平时不有效地预防，到了出现症状时再去治疗，那么，包括鱼药成本在内的重大损失将是不可避免的。 ③ 培养浮动物作饵料

光合细菌营养丰富，这正是浮游动物的优质饵料。实践证明，水体中光合细菌越多，浮游动物生长繁殖越旺盛,以浮游动物为食的鱼类增产效果也就越明显,如 虾、蟹、花鲢、河蚌等。浮游动物作为仔鱼、糠虾、贝苗等开口饵料，营养价值高，易于消化吸收。此外，光合细菌对于刚孵化后，还不能主动捕食的仔鱼是最适宜 的饵料，此时仔鱼的消化系统各器官尚未完全分化，光合细菌通过鳃被吸入体内，在卵囊尚未被完全吸收的同时，即可从外界摄取营养，以弥补内源性营养的不足， 从而大大提高成活率。 ④ 间接增氧

光合细菌分解有机质进行生长繁殖时，不需要氧气，也不释放氧气，它节约了好氧微生物分解有机质时所需的氧，产生间接增氧作用。但随后好氧的浮游动物因得到丰富的饵料，数量剧增，增氧效果就不明显了。

⑤ 饲料添加剂

在相对营养不良的情况下,养殖动物的免疫力下降,有 害菌得以发展，容易出现疾病症状。一般情况下，配合饲料中的活性营养成份较少，饲料系数较高。光合细菌作为优良的饲料添加剂，含有大量的促长因子

和生理活 性物质，营养丰富，拌和饲料后，可补充和增加饲料营养成份、降低饲料系数；刺激动物免疫系统，促进胃肠道内的有益菌生长繁殖，增强消化和抗病能力，促进生 长。 （2）.种植业

光合细菌肯有很强的固氮能力，能够改善土壤的营养结构,肥沃土壤,可作为基肥、追肥。光全细菌在土壤中大量生长繁殖，有利于土壤中有效力微生物（如放射线菌）的生长，减少有害菌群（如丝状真菌）引起的病害。

光合细菌作为农作物，用于水稻和小麦，有利于根系发育，提高有效分蘖和成穗数，用于蔬菜及花卉等，可提高产量和品质，延长保鲜期；用于浸泡种子，发芽率高、生长速度快、抗病力强。对棉花的枯黄、草莓的根腐病等防治效果显著。 （3）环保业

生物学污水处理法是指通过微生物酶的作用，分解和合成有机质。其中起主要作用的是细菌，污水中一些可溶性的有机物在胞内酶的作用下被菌体选择性地吸收； 颗粒、胶体等难溶或不溶性的有机物先附着在菌体外，由菌细胞分泌的胞外酶分解成脂溶性和水溶性物质，再被菌体吸收。通过微生物体内的生化作用，反一部分有 机物同化成自身，另一部分被异化成水分子有机物、二氧化碳、水等，从而使污染物质得到降解。

光合细菌兼性厌氧的我和很强的适应性，使其在污水发酵处理中，作用日益突出。例如光合细菌（荚膜红假单胞菌）可将致癌物亚硝胺转化为无毒的化合物，对于生化需氧量（BOD）高达数千mg/L的有机废水，一些生物膜法及活性污泥法等需氧处理法难以耐受，而光合细菌则可以承受，故在处理高浓度有机废水方面具有广泛的应用前景。 二、 光合细菌培养条件 1、 营养条件

光合细菌细胞体构成元素主要有：碳、氢、氧、氮、磷、钾、钠、镁、钙、硫和一些微量元素等，它们也是所有生物细胞构成的主要物质。一般情况下，细胞鲜重：水占80％-90％、无机盐1％-1.5％、蛋白质7％-10％、脂肪1％-2％、糖类和其它有机物1％-1.5％。其中干细胞含碳45％-55％、氢5％-10％、氧20％-30％、氮5％-13％、磷3％-5％、其它矿物元素3％-5％。光合细菌的细胞壁具有半透性，能选择性地让一些营养元素按一定比例进内，在酶的作用下合成自己的细胞组织和裂新的个体。

营养元素的全面和搭配的合理,是营养条件的关键。根据这一要求,选用多种食品添加剂，科学配方，经特殊加工而成的\"光合细菌培养基\"（图2），基本符合光合细菌生长繁殖所需的营养要求，无毒无副作用，使用安全，固状结晶体便于包装和运输，而且有2年的保质期。用其生产菌液（每毫升含有30-50亿个活菌体），成本每500克仅0.4元，且现制现用，质量明优于市售同类产品。

光合细菌培养基（产品：Q/321081BJA001-2000,即 光合细菌高效生长剂），是光合细菌生长繁殖所需各种营养元素的组合体。每种原料都能得以充分利用，最大限度地生产高浓度的菌液，因此，单位效价的光合细菌 菌液生产成本低、质量好，这无论是对于用户、经销商还是厂家都有很大的益处，对在工农业生产中的推广和普及将产生深远的影响。 2.环境条件

有了营养全面的光合细菌培养基，才是内因，还不能培养出光合细菌菌液。还需有适宜光合细菌生长的环境条件，才能培养出优质的菌液。环境条件具体有以下几个方面：

（1）.培养介质：含菌量较低的清洁淡水、海水或加粗食盐的淡水。从经济、实用的角度考虑，地下水含菌量低，为最佳水源；清洁的地表水也可使用；含氯量较高的自来水应敞口放置两三天或调PH值至偏碱后使用；蒸馏水及纯净水固然很好，但成本太高，可用于提纯菌种。 （2）.酸碱度（PH）值：7.5-8.5最佳（适应范围6-10）。

（3）.水硬度：PH值中性时10度以下。即调节PH值至8.0左右时，培养介质中的乳白色沉淀物不宜过多。

（4）.温度：25℃-34℃最佳（适应范围15℃-40℃）。

（5）.光照度:3000LX-4000LX最佳。即每25千克菌液需用60瓦左右的电灯泡进行光照，当然，太阳光最好且无需成本。

（6）.透气性：密闭、敞口皆可培养，密闭效果更好。

（7）.容器：透明或白色容器；大规模培养可用土池、水泥池等，菌液深度30厘米以下为佳。 三、 增菌培养

光合细菌具有生长优势强，培养条件要求不高，施用对象对菌液纯度要求不十分严格等特点，因而适合用户在普通条件下生产。为了便于了解培养过程，掌握生产 技术，现以样品为例介绍两种培养方法。若培养海水光合细菌，只需将介质换成海水或每25千克淡水加450克的粗食盐即可。

样品：1.光合细菌培养基(简称培养基)1袋)280克)。

2.菌种350克。浓度为每克30亿个活菌体，简称30亿级（图3） 1. 培养方法一：材料（图1）：

本着实用和便于取材的宗旨,特备如下材料，供参考。

1、容器：①清洁透明玻璃瓶或塑料瓶500毫升3只、1250毫升7只

②10升容积的塑料桶1只

③25升容积的塑料桶1只（装水

用）

④50升容积的广口塑料桶1只 ⑤小塑料漏斗1只 ⑥玻璃杯1只 ⑦5升塑料盆1只 2. 水25千克 3. 培养基1袋

4. 菌种（优质成品菌液350克） 5. 精密试纸1本（PH值范围5.5-9.0）

6. 氢氧化钠（烧碱）30克（不得用手触摸，以免烧伤皮肤） 7. 装满水插入温度指示瓶1只 8. 电灯炮3只（25瓦、40瓦、60瓦）

9. 清洁木棒2支（一支20厘米、另一支60厘米） 10. 称量工具：天平、秤

11. 纸箱2个（体积视具体情况而定） 步骤

第一次培养

1. 称取1.25千克的水倒入小塑料盆。

2. 用天平称取培养基14克（图4），放入盆中，用木棒搅动，溶解制成培养基溶液。 3. 用试纸测出溶液的PH值。如是8.0左右为正好；如大于9.0，则需用盐酸下调至8.0（实际上在我国未发现有溶入培养基

后，PH值还超过9.0的水源）；如小于7.5则用氢氧化钠溶液上调至8.0。设测出的PH值为6.5。需上调PH值。

4. 取100克水,倒入玻璃杯中，再取氢氧化钠2克加入，搅拌溶解后，制成氢氧化钠溶液。

5. 将培养基溶液搅动，加入氢氧化钠溶液10%左右，静置半分钟，用试纸测其PH值，如不能达到8.0，搅后再加10%，如此反复，直到PH值调至8.0为至 （图5）。计算所用掉氢氧化钠溶液量,推算出实际用掉氢氧化钠的重量,作为以后制备氢氧化钠溶液的参照数值。上调PH值时，如出现少量白色絮状凝胶团，为 正常现象，不影响培养效果。调好PH值的溶液即为培养液。

6. 从350克的菌种中取出250克，其余备用。将250克的菌种加入到培养液中（图6），搅拌均匀，制成混合培养液，简称菌液。

菌液的重量为：水1250克 +培养基14克（忽略不计）＋菌种250克＋氢氧化钠（忽略不计）＝1500克。菌种与培养液的比例为1：5。

7. 设菌液的密度为1克/毫升，则菌液的体积为1500毫升。取500毫升容积的清洁透明玻璃瓶3只，用漏斗将菌液装入瓶中，拧紧瓶塞。

8. 对菌液进行连续地光照和保温培养。取纸箱一只，将菌液瓶和温度指示瓶贴近纸箱内壁放置，灯炮悬于箱内中部距瓶约10厘米处（图7），保持温度25℃- 34℃。注意观察温度的变化，如果温度过高，应更换小灯泡，仍过高，应打开箱散热，否则会蒸死细菌；如果温度低，应盖上箱盖增温，仍达不到要求，应更换大 灯泡，否则会延长培养时间；室外温度适宜时，也可置于阳光下培养，谨防温度过高（45℃）！

9. 菌液的光照和温度都适宜后，细菌就进入了增殖阶段。每天颜色、气味、PH值、透光度和漂浮物等都有不同程度的变化，情况如下：

前3-4小时,菌种适应培养基,吸收水份和营养物质,细胞膨胀,将要裂殖,液

体无明显变化。

48小时后，菌液的颜色更深，透光度更低，气味更浓，PH值也会有所升高，3-5天后升到9.0左右就不再升高了。

72小时后，菌液中的细菌浓度已很高，效价可达30亿级，颜色深红，有臭味，透光度低，PH值9.0左右，液底有少量淤泥状沉淀物。继续培养几天，细菌 浓度还会继续升高，此时，可将菌液对照剩余菌种（图8），如果浓度已达到或超过菌种，菌液即为成品菌液，培养成熟。10-15天后，菌液浓度达到最高值。 如上述，第一次培养结束后已得到1.5千克的成品菌液，可作为菌种再次培养扩大。 第二次培养

从上述得知现有菌种1.5千克（成品菌液），根据接种比例1：5的要求：

1.称取7.5千克水倒入10升塑料桶中，再用玻璃杯从中取出少许，用于溶解氢氧化钠。 2.称取培养基84克放入桶中，搅拌溶解制成培养基溶液。

3.将培养溶液PH值调节至8.0左右，制成培养液。根据\"第一次培养\"中实际用掉氢氧化钠的重量推算，称取此次的所需量，即第一次实际用量的6倍，将其倒入玻璃杯中，制成氢氧化钠溶液，用于调PH值。

4.将1.5千克菌种加入到培养液中，制成菌液，则菌液的总重量为：水7500克＋培养基84克（忽略不计）＋菌种1500克＋氢氧化钠（忽略不计）＝9千克，即体积为9000毫升。

5.取清洁透明塑料瓶和玻璃瓶，容积为1250毫升的7只、500毫升的1只，

用漏斗将菌液分别装满1250毫升的瓶中，拧紧瓶塞，其余装入500毫升的瓶中。 6.将菌液瓶等放入纸箱，按照第一次培养的方法进行培养。 几天后培养成熟，可得9千克成品菌液，作下次培养的菌种。 第三次培养

经过前两次培养后，菌种已达到9千克，还剩水约16.25千克、培养基182克。根据菌种与培养液的比例为1：5的标准，菌种已明显超过,菌种接入量的增多，有利于缩短培养时间，提高成品菌液质量。 1.将所剩的16.25千克水倒入广口塑料桶中。

2.将所剩的182克培养基加入桶内水中，溶解制成培养基溶液。 3.称取氢氧化钠，调节PH值至8.0，制成培养液。

4.将9千克菌种倒入培养液中，制成菌液。则菌液的重量为：16.25千克水＋182克培养基（忽略不计）＋9千克菌种＋氢氧化钠（忽略不计）=25.25千克。

5.将菌液25.25千克直接留在桶中培养（图9）。取电灯泡一只，悬于桶内液面上10-20厘米处；将温度计插入桶内菌液中；用塑料薄膜盖桶口，进行 连续光照，并保持适当温度。如果温度过低，可将桶置于纸箱内增温。培养过程中适当搅动菌液，使之受光均匀，这样几天后，即可得到成熟的菌液约25千克。 样品培养完毕。

室外温度适宜，可将菌液直接置于阳光下培养。

此时，如果有足够的培养基和水，仍可按菌种与培养液1：5的比例，反复培养扩大。当达到所需用量时，留下一部分作菌种，其余施用。 操作要点： ① PH值8.0左右； ② 菌种接入量不低于1：5； ③ 温度25℃-34℃； ④ 光照度3000LX-4000LX； ⑤ 水硬度10度以下。 2.培养方法二（简便方法）： 材料

1.容器：①清洁透明玻璃瓶、塑料瓶500毫升3只，1250毫升6只 ②50千克容积的广口塑料桶一只 ③小塑料盆1只 ④小塑料漏斗1只 ⑥ 10升容积的塑料桶1只 2.水25千克 3.培养基1袋

4.菌种（成品菌液350克，30亿级） 5.装满水插入温度计的温度指示瓶1只 6.电灯泡3只（25瓦、40瓦、60瓦）

7.清洁木棒两2支（一支20厘米、另一支60厘米） 8.称量工具：天平、秤

9. 纸箱2个（体积视具体情况而定） 步骤： 第一次培养

1.称量水250克倒入小塑料盆。

2.称取培养基2.8克溶于盆内水中，无需调节PH值，制成培养液。

3.取菌种250克加入培养液中，制成菌液。菌种与培养液的比例为1：1。菌液的重量为：水250克＋培养基2.8克（忽略不计）＋菌种250克＝500克，则菌液的体积为500毫升。 4.用漏斗将菌液装入500毫升瓶中，拧紧瓶塞。

5.取纸箱1只，将菌液瓶和温度指示瓶分别贴近纸箱内壁放置。再将电灯泡悬挂于箱内中部（距瓶约10厘米），对菌液进行连续光照和保温培养。注意观察温度的变化（25℃-34℃） 这样，3-5天后培养结束，得到约500克的成品菌液，可作为菌种再次培养。

第二次培养

由第一次培养已得菌种500克，根据菌种与培养液1：1的要求。 1.取水500克倒入小塑料盆。

2.取培养基5.6克溶入盆内水中，制成培养液。

3.将菌种500克加入到培养液中制成菌液。则菌液的重量为：水500克＋培养基5.6克（忽略不计）＋菌种500克＝1000克，即体积为1000毫升。 4.取容积为500毫升的塑料瓶2只，用漏斗将菌液分别装入两只瓶中，拧紧瓶塞。

5.将菌液瓶等放入纸箱，对菌液进行培养，成熟后，可得到约1千克的成品菌液，作为下次培养的菌种。

依照上述方法，再经过3次培养，即可得到成品菌液约8千克作为菌种。 第六次培养：

1.取水8千克倒入广口塑料桶中。

2.取培养基.6克溶入桶内水中，制成培养液。

3.将菌种8千克加入培养液中制成菌液。则菌液的重量为：水8千克＋培养基.6克（忽略不计）＋菌种8千克=16千克。

4.将菌液留于桶中，内悬电灯泡于液面上10厘米处、温度计于菌液中，桶口覆盖薄膜，进行光照保温培养。

成熟后，可得到约16千克的成品菌液，仍作为下次培养的菌种。 第七次培养：

将剩余的水、培养基依次加入盛有16千克菌种的广口塑料桶中进行培养，成熟后可得约25千克成品菌液。

样品培养完毕。

室外温度适宜，可将菌液直接置于阳光下培养。 方法一与方法二的区别是： ①无需调PH值；

②菌种与培养液的比例为1：1； ③培养周期短，质量好； ④单位时间总体增菌量少。 3.大规模生产方法介绍

根据光合细菌具有兼性厌氧、生命力强，易于培养等特点，本着便于取材，节约成本的宗旨，现采用\"方法二\"，以一次培养1吨菌液为例，简要介绍几种形式的培养方法。 1.塑料桶培养法 材料（图10、11）：

①50升的透明或白色清洁广口塑料桶40只

②水1000千克 ③菌种1吨（30亿级）

④培养基1箱（40袋，每袋可培养25千克菌液）。

往每只桶内加入25千克水和1袋培养基,搅拌使之溶解，再往每桶中加入25千克菌种，制成菌液，将温度计插入菌液中，用透明塑料薄膜覆盖桶口，并用橡皮筋扎紧，使之保持相对厌氧培养状态。 室外温度适宜情况下（25℃-34℃），将菌液直接置于阳光充足的地方培养；温度过低，可用透明塑料薄膜搭建温棚，采光增温，仍达不到要求，应采取其它增温措施；温度过高，将菌液置于通风的地方，仍过高，应在桶周围洒水降温。

如连续晴天，7-10天后可培养成熟；若有阴天，培养时间则相对延长，连续阴天，应采用功率较大的电灯泡悬于桶与桶之间，进行连续光照，由于白色塑料桶相对于透明塑料桶透光性较差，因此培养时间会相对延长。培养成熟后即可得到1吨的菌液（菌种除外）。

2.土池（水泥池）培养法

材料：①完好的桶状塑料薄膜（长8米，宽2米），塑料薄膜（长7米，宽4米）（图12）

②土池（长5米，宽1.8米，深0.4米） ③水1000千克 ④菌种1吨（30亿级）

⑤培养基1箱（40袋）

在室外阳光充足的地方，先挖一个长5米，宽1.8米，深0.4米的土池，然后将塑料薄膜覆盖池底，整平，再将桶状塑料薄膜平铺在池中（图13）。一端卷 叠并压紧以确保密封，置于池外。从加端加入1000千克水（图14），40袋培养基和1000千克菌种，制成菌液（图15）。排尽薄膜中空气后，也将此端 卷叠密封，置于池外，使菌液保持相对厌氧状态，保持适当的温度和光照，进行培养。如温度过低，用透明塑料薄膜搭建温棚增温（图16）。这样，约10天后， 可得到1吨的成品菌液（菌种除外）。 补充培养法

假设一个池内常备1吨成品菌液，现仅用掉100千克，为保持常备量，只需将100千克清洁水和4袋培养基补充进去，两三天后，即可培养成熟。

以上方法仅供参考，具体操作可根据实际情况而定。 4.培养过程中菌液可能出现的问题及对策 （1）变淡

原因：接种量过少，菌种老化、杂菌过多,PH值过低或过高,光照不足，温度过低或过高，水的硬度过高。

对策：调节至正常状态。 （2）变黑

原因：气温较高的季节，刚培养好的菌液因长时间失去光照。 对策：施以光照。 （3）变绿

原因：可能是菌液中绿硫菌大量繁殖，多见于高温季节。

对策：连续多次密闭培养，或更换菌种和水源。 （4）变灰

原因：接种量少，菌种不纯，光照不足，PH值过低。 对策：选用优质菌种，按要求接种，增强光照，调适PH值。

四、光合细菌的保存

光合细菌生长繁殖除营养条件外，还与光照和温度有关。温度适宜，即使光照不足，也会生长，只是速度缓慢；温度较低，即使光照充足，也很难甚至停止生长；温度过高，则会老化而死。因此保存菌液，温度是关键。

据此，成品菌液应存放在温度较低的地方，15℃以下为最佳，并保持一定的光照（每天不低于2小时），这是因为光合细菌在营养、光照、温度都适宜的情况下，形成一定速度的生长态势，即\"生长惯性\"，处在生长高峰期的光合细菌生长惯性很强，此时如果突然失去光照或光照很弱，5-10天后，会出现生长旺盛的光合细菌因光合作用失衡，而导致菌体细胞大量死亡，使菌液发黑，并有恶臭。刚开始发黑时，施以适当光照即能缓解。所以刚培养好的菌液应尽量降温，逐步减少光照，以减弱生长惯性。到了生长惯性很弱或没有的时候，光合细菌就进入了稳定期（保存期）。此时阴凉避光保存会延长保存期（六个月）。 当然，削弱生长惯性不单靠降温，减少光照等外部条件，与内因也有很大的关系，如光合细菌生长达到高浓度的时候,由于代谢产物积聚增多,所产生的一些有害因子会抑制本身繁殖；培养基内部的缓冲体，在菌液达到高浓度的时候，也会发挥缓冲的作用。

通常,用户在生产过程中，对菌液的保存无须作特别处理。气温高的季节,在阳光下培养，成熟的菌液仍置于阳光下，不必避光，保存期2-4个月，在此期间可反复培养续种，秋天，气温下降后，培养好一批菌液过冬，冰冻前移至室内避光保存，保存期8-12个月。

总之，保存期的长短，主要取决于温度的高低，温度越低，保存期越长，反之越短。 五、 合细菌菌种的简易提纯 1.菌种提纯 （1）选择性培养基

光合细菌适宜PH值在8.0左右，在9-10的高碱度情况下仍能生长，而一般杂菌适宜的PH值在7.2-7.6左右。若把菌液的PH值调节至9.0，杂菌难以耐受甚至死亡，而光合细菌则可以承受并能生长。这样可筛除一部分杂菌。 （2）选择优质菌种

细菌的生长繁殖一般按倍数的规律增长。假设菌种内的杂菌含量较高，培养几次后，它们在菌液中的比例不会减小，有些杂菌的生长速度较光合细菌快，比例可能还会增大。老化的光合细菌活性较差，菌液内的有害代谢物质较多。

因此，菌种应选用浓度高、活性强、杂菌少鲜紫红色的菌液。 （3）优势接种量

大规模生产过程中，由于水源、容器及空气中的杂菌是不可排除的，因而应加大接种量使光合细菌占绝对优势,这样才能培养出高质量的菌液。光合细菌含量高了,还能释放抑菌酵素，抑制一些杂菌的生长。 究竟多在接种量为好呢？实践证明，正常的接种量应不低于1：5，即菌种1份(30亿级)，培养液5份；培养液不调PH值和提纯菌种时,其接种量应不低于1：1,即菌种和培养液各一份，这样，培养周期短，质量

好，缺点是保种量多。 （4）好氧培养

将菌液用增氧机砂头充氧曝气，培养两天，可有效的抑制一些厌氧菌的生长。 （5）厌氧培养

将菌液装入透明密封容器内进行培养，可有效抑制一些好氧菌的生长。

以上几种方法的综合运用，可将光合菌菌液适当提纯，反复接种，从而使不具备专业知识的用户自已也可以生产出优质菌液 六、 光合菌浓度的简易计算 （1）比例法

取已知血红细胞数的血液与待测菌液各1毫升充分混合，涂片、染色固定、镜检，分别数出视野内血红细胞及待测菌细胞的个数，需重复上述操作十次以上，算出视野内血红细胞以及菌细胞的平均数，即得出待测菌液的浓度，比例式为： （2）比较法

将待测菌液与已知浓度的菌液进行比较。如它们的红色度，透光度大致相同，则它们的浓度也大致相等，如待测溶液比已知浓度菌液红色度深，透光度低，说明待 测菌液浓度高于已知菌液，定量加水稀释待测菌液，使之与已知菌液红色度，透光度相同，那么待测菌的浓度为：已知菌液的浓度乘以待测菌液稀释后的倍数；如待 测菌液比已知浓度的菌液红色度浅，透光度高，说明待测菌液的浓度低于已知菌液，定量加水释已知菌液，使之与待测菌液浓度相同，那么，待测菌液的浓度为：已 知菌液的浓度除以已知菌液稀释后的倍数

八、光合细菌的使用剂量、方法及注意事项

光合细菌对各类养殖动物及农作物都有益。表现在成活率高、个体大、免疫力强等方面。特别是育苗阶段，效果更明显。 1.使用剂量（30亿级） （1）育苗

鱼苗培育：一般施用浓度100-200ppm(1ppm为百分之一，即1立方水体用1克)。常规鱼苗100 ppm，虾蟹苗150-200 ppm，贝苗180-200 ppm，使用周期为5-10天。 （2）成鱼

首次施用10 ppm(即水深1米每亩约用7千克)，以后每次5 ppm(即水深1米每亩约4千克)，周期为10-15天。如常规鱼、虾、蟹、珠蚌、鳗等。 （3）饲料添加

鱼苗5%，成鱼3%，禽畜3%-5%，现拌现喂，喂水添加3%。 （4）种植业

水稻、小麦：每次亩用5千克叶面喷施。水稻秧苗期、孕穗期各用一次；小麦冬肥、拔节期各用一次。 油菜：基肥亩用15千克浇根。窜苔前亩用15千克叶面喷施。

瓜果类蔬菜：每次亩用10千克，幼苗期适量稀释浇根一次，现蕾期喷施一次。 叶菜类蔬菜：每次亩用20千克，生长期浇根或叶面喷施，7天用一次。 花卉：移载后亩用40千克浇根。生长期每次亩用20千克喷施，每15天一次。

茶树：播种基肥亩用80千克。冬肥亩用40千克浇根。萌发期前亩用20千克浇根。叶片生长期亩用15千克喷施，每15天一次。

果树：冬肥亩用40千克浇根。新叶长成后亩用20千克叶面喷施。 （5）环保

污水处理用量：200-1000ppm。 2.使用方法

（1）将光合细菌菌液稀释20-30倍全池均匀泼洒。

（2）将菌液用沸石粉吸附或拌和细土以后撒入池中。 （3）将菌液拌和饲料后投喂。 （4）将菌液稀释10倍后，浸泡鱼种。 （5）拌种、浇根、叶面喷施。 3.注意事项

（1）不可与消毒杀菌剂混合使用，水体消毒须1周后方可使用。 （2）使用前，将菌液光照10小时以上，使用效果更好。 （3）晴天水温20℃以上时使用效果较好。 （4）拌入的饲料应于当天投喂完毕。

（5）应灵活掌握用量和使用的连续性，因为光合细菌在水体中只有形成优势群落后，才能发挥最大的作用。

（6）水体呈碱性时施用效果最好。酸性水体易使鱼类生病，应常用生石灰或烧碱调节PH值至中性或偏碱程度。

（7）光合细菌菌液不能用金属器皿贮存。

（8）培育鱼苗时，在苗种入池前7天全池泼洒，以利于浮游生物生长。 （9）植物萌发期，施用效果最好。 附录：

1.光合细菌的镜检方法（细菌的涂片和革兰氏染色法） 1.涂片

以灭菌接种环取一滴盐水放于清洁玻片上，然后挑取少许细菌与盐水混匀，均匀涂布。 2.干燥

将标本涂好后，使自然干燥，或在火焰上略烘，但防止过热。 3.固定

将已干燥标本在火焰上来回通过3-4次，可使细菌固定在玻片上。 4.染色，有以下四个步骤

（1）初染：在涂片上加结晶紫染液1分钟后，用自来水冲洗，将水沥净。 （2）媒染：加碘液作用1分钟后，水洗沥净。 （3）脱色：用95%的酒精，约10-30分钟，水洗。 （4）复染：加稀释复红染半分钟，水洗，用滤纸吸干。 （5）干燥后：加香柏油镜检。

（6）观察结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

光合細菌

光合細菌概論

光合細菌（Photosynthetic bacteria，簡稱PSB）是廣泛分布於水田、 河川、海洋和土壤中的一大類細菌，為革蘭氏陰性細菌。在厭氣環境下可利 用光能進行光合作用，以H2S和有機物作為供氫體，以CO2或有機物作為碳 源。在不同的環境條件下，也可能有多樣的異營功能（固氮、脫氮、固碳、 氧化硫化物等），在自淨過程中，有著不同的角色。

除了淨化水質外，進一步的研究發現光合細菌對魚、蝦、蟹、貝類幼 體具有促進生長，提高存活率的作用。這可能是因為光合細菌菌體富含營養 物質，其蛋白質含量超過大豆，維生素B群種類與含量超過酵母，特別是維 生素B12、葉酸和生物素等含量豐富。另外，重要生理活性物質的輔\"酉每\" Q在光合細菌中含量遠超過其他生物。

光合細菌應用在水產養殖上，主要在五個方面上

    

作為水質淨化劑 作為飼料添加劑

用於水產動物幼體培育

作為動物性生物餌料的餌料 防治魚病

光合細菌生物學

光合細菌是地球上最早出現的具有原始光能合成體系的原核生物， 光合細菌根據光合作用是否產氧，可分為不產氧光合細菌和產氧光合細菌； 又可根據所利用碳源的不同，將其分為光能自養和光能異養型，前者是以硫 化氫為光合作用供氫體的紫硫細菌和綠硫細菌，後者是以各種有機物為供氫 體和主要碳源的紫色非硫細菌。目前根據光合細菌所具有的光合色素體系和 光合作用中是否能以硫為電子供體將其劃分為4個科： 1. Rhodospirillaceae（紅螺菌科或稱紅色非硫菌科） 2. Chromatiaceae（紅硫菌科） 3. Chlorobiaceae（綠硫菌科）

4. Chloroflexaceae（滑行絲狀綠硫菌科）

綠硫細菌、紅硫細菌（過去叫做紫硫細菌）和紅螺細菌（過去叫做紫 色非硫細菌）等，都是能夠進行光合作用的細菌，大多數都不能夠運動。這

些細菌的菌體內含有類似於葉綠素的光合色素，這種光合色素叫做細菌葉綠 素。有的光合細菌還含有大量的類胡蘿蔔素，而使菌體呈現出紅色。

光合細菌中，目前生產的主要種類為紅螺菌科的屬、種，如莢膜紅假 單胞菌（Rhodopseudomonas capsulatus）、球形紅假單胞菌（Rps.globiformis） 、沼澤紅假單胞菌（Rps.palustris）、嗜硫紅假單胞菌 （Rps.sulfi-dophila）、深

紅紅螺菌（Rhodospirillum. rubrum）、黃褐紅螺菌（Rhodospirillum.fulvum）等。

培養物顏色

光合細菌具有光合色素，包括細菌葉綠素和類胡蘿蔔素等。 紅螺菌科 紅硫菌� 綠硫菌科 培養物顏色 細菌葉綠素 光合作用器光合反應硫粒子主要 管 的供氫體 的蓄積 碳源 有機物 H2S 沒有 運動性紅、粉紅、紫、橙黃、茶a 或 b 載色體 褐 紅、粉紅、紫、茶 綠 a 或 b 載色體 有機物 + +，- - 細胞內 CO2 細胞外 CO2 a 和 c 綠色包囊 H2S d 或 e a 或 c 綠色包囊 有機物 H2S 絲狀綠硫菌綠、橙黃 科 細胞外 有機物 + 紅螺菌科和著色菌科的菌體顏色來自於類胡蘿蔔素較高，掩蓋了細菌 葉綠素。根據體內含有的細菌葉綠素和類胡蘿蔔素的種類和數量不同，因而 呈現不同的顏色。另外，由於培養條件的不同，顏色也有所變化，這是由於 氧的存在會抑制光合細菌色素合成。

光合細菌的菌種分離和菌種保存技術

菌種的分離，是從它生活的環境中，與混雜的微生物群分離出來。這 是獲得優良菌株最基本且必要的手段。

菌種大量培養

目前應用於有機廢水淨化和水產養殖業上的光合細菌，主要是紅螺菌 科中稱為紫色非硫細菌中的一些種類，包括紅螺菌屬（Rhodosirillum）、紅 假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、和紅微菌屬（Rhodomicrobium）在

內的三個屬，共同特徵是具鞭毛有運動性，不產生氣泡，細胞內不積累硫化 物。 採樣：

光合細菌生長條件，主要有水、有機質和厭氧環境。因此，在河底、 海底的泥土及水田、溝渠等經常含有有機物的泥土上，有著呈橙黃色、粉紅 色塊狀沉積物的泥土，都可以採取分離光合細菌的樣品。 培養方式：

目前在水產養殖上應用的光合細菌，主要是光合異營型紅螺菌科，其 中以紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）為主。採用的養殖方法有兩種， 全封閉的厭氣光照培養方式，開放式的微氣光照培養方式。

1. 全封閉式的厭氣光照培養

採用無色透光的容器，消毒後裝入培養液，接入20~50%的菌種母液，將 容器中灌滿培養液，加蓋造成厭氣的培養環境。，置於有陽光的地方或用 人工光源進行培養，達到指數生長期高峰時，可作為菌種器液接種。 2. 開放試微氣光照培養

可採用100-200L容量的的塑膠桶或500L容量的豐年蝦孵化桶為培養容器 。在底部裝打氣石，培養時微充氣，使桶內光合細菌上下緩緩翻動。在 桶的正上方約30cm左右加裝人工光源，使液面照度達2000lux。容器消 毒後裝入培養液，接入20~50%的菌種母液，照明，微充氣培養。 培養基

對培養光合自營型細菌，一般用無機鹽為基礎培養基，加入適量的碳 酸氫鹽作為二氧化碳的來源，用磷酸調整pH 7.0~8.0，然後加入0.05~0.1% 的Na2S．9H2O作為電子供體和供氫體，在光照厭氣環境，20~30℃培養。 培養光合異營型的細菌則需在無機鹽培養基中再加入0.2%酵母膏、0.25% 乙酸鈉、0.02%丙酸鈉和5%NaHCO3，調整其pH至7.0-8.0，根據環境需求 而定。

紅螺菌科配方 NH4Cl NaHCO3 *1 K2HPO4 CH3COONa MgSO4．7H2O 著色菌科配方 1.0g 1.0 0.2 1-5g 0.2g NaCl T．m．儲液 *2 生長素輔助因子儲液 *3 蒸餾水 *4 pH *4 0.5-2.0g 10ml 1ml 1000ml 7.0 NH4Cl 1.0g MgCl 0.2g NaHCO3 K2HPO4 Na2S *5 綠桿菌科配方 1.0g 0.5g 1.0g T．m．儲液 *2 蒸餾水 *4 pH *4 10ml 1000ml 8.0-8.5 NH4Cl NaHCO3 K2HPO4 Na2S *5 1.0g 1.0g 0.5g 1.0g MgCl T．m．儲液 *2 蒸餾水 *4 pH *4 0.2g 10ml 1000ml 7.3 *1 事先製備5%NaHCO3水溶液，經過濾除菌，取20ml與另外經高壓滅菌 的培養基混合 *2 微量元素儲液：FeCl3 5mg、CuSO4．5H2O 0.05mg、H3BO3 1mg、 MnCl2．5H2O 0.05mg、ZnSO4．7H2O 1mg、CO（NO3）2．6H2O 0.5mg、蒸餾水 1000ml *3 生長輔助因子：維生素B1、P-胺基苯甲酸、根據不同菌種加入。 *4 光合細菌如為海水種，改用人工海水，並調整pH值 *5 事先製備10% Na2S水溶液，經過濾除菌，取10ml與另外經高壓滅菌 的培養基混合。培養紅硫菌（Chromatium）時，可再Na2S水溶液中加入 0.2%馬來酸鈉等有機酸來促進生長。 培養方法

光合細菌的培養，按次序分為容器、工具的消毒，培養基的製備，接 種和培養管理四個步驟。

（一）容器、工具的消毒，參考微藻培養方法部分。 （二）培養基的製備

1. 淡水種光合細菌使用消毒過的淡水製備，生產培養可用消毒的自來水 （或井水）配製。如果培養海水種光合細菌則用天然海水配製培養基， 在海水中加入磷元素時，不能用K2HPO4，應用KH2PO4，不然會產生 大量沉澱。

2. 滅菌和消毒菌種培養用的培養基應連同培養容器用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌 。大型生產性培養則把經沉澱砂濾後的水用漂白液消毒後使用。

3. 培養基配製根據所培養種類的營養需要選擇合適的培養基配方。按培養 基配方把所需物質稱量，逐一溶解，混合，配成培養基。也可先配成母 液，使用時按比例加入一定的量即可。 （三）接種培養基配好後，應立即進行接種。光合細菌生產性培養的接種量 需求較高，一般為20％～50％，即菌種母液量和新配培養液雖之比為1：4

～1：1，不應低於20％，尤其是微氣培養，接種量更應高些，否則光合細菌 在培養液中很難佔絕對優勢，影響最終產量和質量。 （四）培養管理

光合細菌的培養過程中，管理工作包括日常管理操作和測試，生長情 況的觀察、檢查以及出現問題的分析處理等三個方面。

日常管理和測試

1. 攪拌和打氣：光合細菌培養過程中必須幫助沉澱的光合細菌上浮獲

得光照，保持菌細胞的良好生長。大型厭氣培養則用機械攪拌或使 用小型沉水馬達使水緩慢循環，保持菌體懸浮。

微氣培養是通過打氣幫助菌體上浮，因為打氣會使溶氧含量增加， 光合細菌繁殖受到抑制，所以必須嚴格控制供氣量。一般採用定時 斷續充氣，充氣量控制在1～1.5L／（L*hr）之間，溶解氧量保持在

1ppm以下。 2. 調節光照度：培養光合細菌需要連續進行照明。白天可利用日光培

養，晚上則使用人工光源，或完全利用人工光源培養。一般培養光 照強度應控制在2000～5000 lx之間。如果光合細菌細胞密度高，則

光照強度應提高到5000～10000 lx。

3. 調節溫度：光合細菌對溫度的適應範圍在23～39℃內，均能正常

生

長繁殖，可不必調整溫度。 常溫下培養也可通過調整，將溫度控制

在光合細菌生長繁殖最適宜的範圍。

4. 酸鹼度的測定和調整：培養光合細菌必須注意酸鹼度的變化。 光

合

細菌大量繁殖時，菌液pH值上升，此時為指數生長期。但當pH 值 超過生長的適應範圍時，光合細菌生長下降。 如果能及時調整，使

pH值保持在最適範圍，則光合細菌能繼續生長繁殖。測定和調整pH 值，可以讓光合細菌保持在指數生長期。一般採用加酸的辦法來降 低酸鹼值。醋酸、乳酸和鹽酸均可使用，最常用的是醋酸。日常管 理工作中，必須每天或隔天測定pH值，當pH值上升超出最適範圍， 即加酸調整。

 生長情況的觀察和檢查

光合細菌生長情況的好壞是培養成敗的標準。在培養過程中，可以通過 觀察菌液的顏色及其變化來了解光合細菌生長繁殖的大體情況，菌液的 顏色是否正常，接種後顏色是否由淺變深，均反映光合細菌是否正常生 長繁殖以及繁殖速度的快慢。 必要時可通過顯微鏡檢查，了解情況。  問題的分析和處理

通過日常管理、檢測、檢查，了解光合細菌的生長情況，就可以結合當



時環境條件的變化進行分析，找出影響光合細菌生長繁殖的原因，採取 相應的措施。

影響光合細菌生長的原因很多，內因是菌種是否優良，外因是光照、 溫度、營養、敵害和厭氣程度等。溫度、光照和pH值都能影響著光合細菌 的生長，而且溫度、光照和pH值之間是互相制約的，溫度與光照的強弱是 對立統一的，所以光合細菌生長的最適條件應是互應的，即溫度高，光照 應弱；溫度低，光照應強。 如果是溫度高，光照強，pH值就會迅速升高， 培養基產生沉澱，抑制光台細菌的生長；如果溫度低，光照弱，光合細菌 得不到最佳能源，生長速度也慢。 經試驗得出光合細菌生長的最適條件是：

1. 溫度15～20℃時，光照30000～50000 lx，培養基pH值為7.0

2. 溫度25～30℃時，光照為3000～5000 lx，培養基的pH值為7. 0

。