免疫荧光

一：1.烤片2h

2.水化：二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→无水酒精（5min）→95%酒精（5min）→75%酒精（5min）

3.PBS清洗3次，每次5min （不用H2O2封闭）【清洗过程中需同时配置柠檬酸盐缓冲液（1袋配1L）并用高压锅加热致沸，约5min】；

4.抗原修复：玻片置入沸腾柠檬酸盐修复液中煮沸10min，冷却至常温（严格室温下冷却，前期勿人为降温）；

5.将修复液定容至1L（蒸发约150ml），玻片放入塑料盒中，微波炉高火修复5min，冷却至常温（室温下冷却）；

6.PBS清洗3次，每次5min；

7.滴加封闭血清（2％ BSA“牛血清白蛋白 ”或免疫组化试剂盒北京中衫中的封闭液“使用二抗抗体所属动物种类的血清”）在湿盒中37℃封闭30分钟。

8.用滤纸擦去封闭液，勿洗。 抗原抗体结合：加入一抗【一抗配置：不同抗原对应不同一抗(保存于4℃或-20℃试剂盒中)，一抗需稀释，各种抗体浓度不同，需调试，一般采用1：100，即10ul一抗稀释至1ml，操作台上取EP管加入10ul一抗后再加入PBS至1ml即可（注意操作低温环境，一抗保存温度较低，滴加时EP管需放置在冰沙里；用移

液滴加；纱布擦干玻片周围，滤纸吸干表面）】；

9．4℃冰箱过夜（玻片盒中底部铺湿纱布，保证潮湿环境，一般需10-12h，注意时间安排）；

二：1.过夜后取出玻片→PBS清洗3次（5min→10min→15min）；

2.避光滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时，用PBS 5分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。

3.滴加DAPI（1mg/ml，用PBS配制）避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳。用PBS 1分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS。

4.自然避光晾干，最后用含甘油（甘油1:1PBS） 封片，并在荧光显微镜下立即观察。