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Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｉｐｉｎｇ １３６０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）ｉｎ ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ——ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ——ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｌｅａｎ— ｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ＢＳＡ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅ１１ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｓｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬｌＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ＢＳＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙ— ｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅ１１ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｗａｙ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｌｅａｎｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ＢＳＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅ１１ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｗａｓｈｉｎｇ ｔｉｍｅ ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ＢＳＡ ｒｅｓｉｄｕｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏ ｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ．ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｓｕｃｈ ａｓ ＢＳＡ ｈｅｔｅｒｏｌｏ— ｇｏｕｓ Ｄｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ＢＳＡ ｔｏ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｒｅｓｉｄｕｅ ｏｆ 基金项目：吉林省科技发展计划资助项目（２０１３０１Ｏ１１６５ＪＣ） ＊通讯作者 中国实验诊断学２０１３年１０月 第１７卷第１Ｏ期 １７６５ ■ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｌｅａｎｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ＢＳＡ； ｗｉｔｈ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ＢＳＡ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＢＳＡ ｒｅｓｉｄｕｅｓ；Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｅｌ ＩＳＡ；ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ 问充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， 版《中国药典》三部附录中牛血清白蛋白残留量检测 ＭＳＣｓ）是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能 方法的规定进行，采用酶联免疫法测定供试品中残 的干细胞，是造血微环境中一种重要细胞成分，目前 余牛血清白蛋白含量。本文采用酶联免疫法测定细 临床实验证实间充质干细胞移植可用于组织的修复 胞不同清洗程序和培养基条件中ＢＳＡ残留量的检 及治疗间充质组织遗传缺陷性疾病，临床应用前景 测，探讨不同清洗程序对细胞产品中ＢＳＡ残留量的 广阔口 ］。根据２０１３年国家《干细胞制剂质量控制 影响，从而为建立合理有效的清洗程序和检测标准 及临床前研究指导原则（试行）》的规定，干细胞治疗 提供试验依据。 作为一种新型的生物治疗产品，所有干细胞制剂都 １材料和方法 可遵循一个共同的研发过程，即从干细胞制剂的制 １．１样品与试剂 备、体外试验、体内动物试验，到植入人体的临床研 用于检测的干细胞为脐带源间充质干细胞，足 究及临床治疗的过程。整个过程的每一阶段，都须 月剖宫产健康胎儿脐带，经产妇知情同意及医院伦 对所使用的干细胞制剂在细胞质量、安全性和生物 理委员会批准，取自四平市中心医院妇产科，进行常 学效应方面进行相关的研究和质量控制。 规分离。选用流式细胞仪分析Ｐ５细胞检测表 根据指导原则中的规定，在干细胞的采集、分离 型［５］。ＢＳＡ残留量检测使用试剂盒为无锡博生医用 及干细胞（系）建立阶段，除进行细胞鉴别、成活率及 生物技术开发有限公司的定量检测牛血清白蛋白 生长活性检测以外，还应进行全面的内外源致病微 （ＢＳＡ）酶联免疫试剂盒，批号：２０１２０６０２。 生物、详细的干细胞特性检测，以及细胞纯度分析。 １．２ 试剂 —ＭＥＭ培养基购自美国Ｔｈｅｒｍｏ 其中细胞内外源性细胞因子的检测项中明确提到如 Ｆｉｓｈｅｒ公司，胎牛血清购自美国Ｇｉｂｃｏ公司，无血清 使用过牛血清，须进行牛源特定病毒的检测包括 培养基购自杭州百通生物科技有限公司。 ＢＳＡ残留量检测。而目前尚无对细胞产品牛血清 １．３方法干细胞样品制备见表１。 白蛋白残留量检测的标准化方法，主要参照２０１０年 表１干细胞样品制备 １．４ ＥＬＩＳＡ法检测ＢＳＡ残留的方法 将待测样品 孵育３０ ｍｉｎ；洗板后加入底物液并避光孵育１０—１５ 与ＢＳＡ标准品加入包被有ＢＳＡ抗体的９６孔板中， ｍｉｎ，加入终止液后轻轻震荡，并在４５０ ｎｍ单波长下 ３７。Ｃ孵育１小时，洗板并加入酶标记抗体，室温避光 读数。 １７６６～ Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０１３，Ｖｏｌ １７，Ｎｏ．１０ １．５统计学处理 实验重复至少３次，数据用 ±Ｓ ｍ１），同时也是引起过敏反应的最主要因素之一。 表示，多组间均数差异性比较采用单因素方差分析 ＢｓＡ，作为异源蛋白的代表，能够引起机体的多种免 （目。 ｖ魁白。 ＿（Ｏｎｅ—ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。数据采用Ｐｒｉｓｍ ５．０软件进 疫反应ｌ８ 。因此，检测ＢＳＡ的残留被作为国家对 ｌ ８ ６ ４ ２ ０ ２ 行分析。 ２ 结果 生物制品质量控制的重要指标。 与其他生物制品不同，细胞产品的纯化与清洁 ｈＵＭＳＣｓ自脐带中分离培养，并传至Ｐ３时形态 只能通过规范的清洗程序，以减低及清除对机体多 学上显示成纤维细胞形态，细胞呈漩涡样生长。流 种不利的影响因素，以达到国家对细胞制品的标准 式细胞术检测ｈＵＭＳＣｓ表达ＣＤ７３，ＣＤｇ０和 要求。通过本次试验证实，细胞培养至Ｐ５，ＰＢＳ清洗 ＣＤ１０５；不表达ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ１４，ＣＤ１９，ＨＬＡ— ３次后细胞中ＢＳＡ残留量可达到４０ ｎｇ／ｍｌ以内，而 ＤＲ＿６］。ＥＬＩｓＡ酶联检测试剂盒测定方法计算结果 且采用无血清培养能从细胞培养的源头有效地避免 显示，根据标准浓度绘制标准曲线得到标准方程Ｙ一 ０．Ｏ２４Ｏｚ一０．０３１３，Ｒ。一０．９９４ １，标准曲线见图１。 使用常规培养基ａ—ＭＥＭ １０ 胎牛血清中培养传至 Ｐ５时，ＰＢＳ清洗１次后干细胞溶液中残留ＢＳＡ为 ｌ１７．５８ ｎｇ／ｍｌ，ＰＢＳ清洗３次后干细胞溶液中ＢＳＡ 的残留量下降为３６．６０ ｎｇ／ｍｌ。使用无血清培养基 进行细胞培养，样品中ＢＳＡ的残留量随着细胞的传 代次数至Ｐ５时有明显的减少趋势，从Ｐ３时的９５．１２ ｎｇ／ｍｌ下降到Ｐ５时的５．９６ ｎｇ／ｍｌ。同时，冻存后的 细胞样品经过复苏后培养，ＢＳＡ的残留为２４．６５ ｎｇ／ ｍｌ。计算结果见表１。 Ｒ２＝０．９￣１／ ／ ／ ・枥 曲线 ／ ／ －澳 样品 一绩 （标准曲线） 。，．／ ． ． ．Ｉ １０ ２Ｏ ３Ｏ ４０ ５ 图１ 根据标准浓度绘制散点图 表１根据标准曲线计算得到的测定样品残留的ＢＳＡ含量 ３讨论 牛血清是细胞培养和扩增过程中培养液的重要 组分，是细胞培养中用量最大的天然培养基，也是许 多生物制品保存液中的必要组分之一。在牛血清 中，ＢＳＡ是牛血清中的主要成分（约为３５—５０ ｍｇ／ ＢＳＡ的残留，这对于提高细胞生物制品的生物安全 性，推动干细胞生物产品走向规模化及市场化，从而 有效地造福人类健康具有重要作用。 作者简介：宛莹（１９８３一），女，博士，目前主要从事干细胞分离 鉴定及干细胞对抗肝纤维化作用的机制研究。 参考文献： ［１］Ａｇｇａｒｗａ［Ｓ，Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ．Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｍｏｄｕ ｌａｔｅ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（４）： １８１５． ［２］Ｅｒｉｃｅｓ Ａ，Ｃｏｎｇｅｒ Ｐ，Ｍｉｎｇｕｅｌｌ ＪＪ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ［Ｊ］．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，２０００，１０９（１）：２３５． Ｉｎ］Ｙｅｎ 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